Protokollen beskrevet heri er en metode til måling af endoreduplikation inden for knolde af kartoffel (Solanum tuberosum). Det omfatter plasmolysis og protoplast udvinding skridt for at mindske støj og vragrester i downstream flow cytometric analyse.
Endoreduplikation, replikation af en celle nukleare genom uden efterfølgende cytokinesis, udbytter celler med øget DNA indhold og er forbundet med specialisering, udvikling og stigning i cellulær størrelse. I planter synes endoreduplikation at fremme vækst og udvidelse af visse væv og organer. Blandt dem er knold af kartoffel (Solanum tuberosum), som undergår betydelig cellulære ekspansion i opfylder sin funktion af kulhydrat opbevaring. Endoreduplikation kan således spille en vigtig rolle i hvordan knoldene er i stand til at rumme denne overflod af kulstof. Dog celleaffald som følge af rå nukleare isolation metoder af knolde, metoder, der kan bruges effektivt med blade, udelukker estimering af knold endoreduplikation indeks (EI). Denne artikel præsenterer en teknik til at vurdere knold endoreduplikation gennem isolation af protoplasts, mens demonstrere repræsentative resultater opnået fra forskellige genotyper og opdelte knold væv. De store begrænsninger i protokollen er tid og reagens omkostninger kræves for prøveforberedelse samt relativt korte levetid for prøver efter lysering af protoplasts. Mens protokollen er følsomme over for tekniske variation, repræsenterer den en forbedring over traditionelle metoder af nukleare isolation fra disse store specialiserede celler. Muligheder for forbedringer i protokollen som genbrug enzym, brugen af fikseringsmidler, og andre ændringer er foreslået.
Endoreduplikation er den proces, hvorved en celle giver afkald på den typiske cellecyklus og i stedet gennemgår en alternativ kursus udvikling består af gentagne runder af DNA-replikation uden cellulære division. Den resulterende celle vil have øget DNA indhold og nukleare størrelse, som menes at spille en rolle i cellulære regulering, udbygning og specialisering. Generelt, en runde af endoreduplikation (kaldt en endocycle) og den tilsvarende stigning i DNA indhold er forbundet med større cellevolumen, en observation, der bundfældes “karyoplasmic theory”, at øget DNA indhold skal korrekt regulere en større, måske mere komplekse, celle1. Dette fænomen er udbredt i højere planter, efter at have været observeret i en række væv, herunder dem med strukturelle/defensiv (trichomes)2,3, nærende (majs endosperm)4,5, og vask/opbevaring ( tomat sølvhinderne; kartoffel knolde)6,7,8 funktioner. I frugt, er det blevet foreslået, at endoreduplikation spiller en rolle i at lette den hurtige ekspansion af sølvhinder, som det fremgår af negative sammenhængen mellem endoreduplikation og frugt udviklingsmæssige periode9. For eksempel celler med DNA indhold op til 512C (512 gange den haploide genom) er blevet observeret i tomat sølvhinderne8. Endvidere Chevalier et al. (2014) viste, at ændringer i udtrykket af gener, celle cyklus kan føre til stigninger i endoreduplikation niveauer inden for sølvhinder som så resulterer i større frugt10. Således giver ændring af gener fremme endoreduplikation et potentielt mål for forbedring af biomasse eller udbytte gennem planteavl eller genetisk manipulation. Sådan forbedring er dog betinget af større forståelse af årsagerne og konsekvenserne af endoreduplikation.
Endoreduplikation er oftest målt via flowcytometri hvorved kerner, udgivet i rå væv præparater11, inkuberes med en DNA-bindende fluorophore, såsom propidium Iodid12 (PI). De filtrerede prøver er derefter forbi laser af et flow forskellige hvor emission bølgelængder specifikke til fluorophore kan overholdes. Intensiteten af fluorescens i hver event (dvs., nucleus) er direkte korreleret med DNA-indhold af partiklen. Således, ved at sammenligne med en kendt standard, kan den relative og absolutte DNA indhold af celler i en given prøve beregnes. Endoreduplikation indeks (EI) bestemmes ved at etablere det gennemsnitlige antal endocycles pr. celle i en prøve ved at observere cellulære DNA indhold (C-værdien) hvor 1C er DNA indhold af en haploide celler (formel præsenteret i trin 6,7 i protokollen). For eksempel, i en diploide organismer er basisindhold DNA i somatiske celler 2C. Hvis en prøve har få celler med 4C, svarer til en enkelt runde af endoreduplikation og større ville det have en EI nær 0; men hvis næsten alle celler er 4C EI ville være ca. 1. Flere runder af endoreduplikation er fælles i højere planter observerede EI værdier kan dog være langt større. Mens beregning af endoreduplikation indekser kan relativt nemt, det kræver, at relative mængder af kerner C-værdierne være pålideligt konstateres, som er udelukket i visse arter og væv (herunder kartoffelknolde). Det er sandsynligt, at forskelle i cellulære anatomi, kemi eller cellevæg sammensætning13 forårsage disse prøver at være genstridige at de typiske præparater, der ved hjælp af et barberblad til at frigive kerner direkte i passende buffere, der er almindeligt anvendt med væv såsom tomat sølvhinder, en model for endoreduplikation undersøgelser8.
I kartoffel forbliver undersøgelse af endoreduplikation i knolden begrænset til bare et par undersøgelser, måske delvis skyldes en mangel på en pålidelige protokol som de førnævnte rå præparater give inkonsistente resultater. Mens sådanne tilgange arbejder godt for blade knold prøver oplever alvorlig nedbrydning og en overflod af støj i form af snavs, at differentiering af toppe består af kerner med forskellige C-værdier næsten umuligt. Det er måske på grund af forskelle i cellulære sammensætning og et væld af celleaffald i knolden celler (f.eks. stivelse-opbevaring amyloplasts). For at overvinde denne forhindring, udviklet vi for nylig en mere pålidelige protokol for at erhverve skelnes toppe i flowcytometri af kartoffelknolde. Hyppigheden af celler i hver top kan derefter bruges til at beregne præcise endoreduplikation niveauer for forskellige genotyper eller forskellige væv, der udgør en knold. Den protokol, der beskæftiger en modificeret protoplast ekstraktion metode14,15 antecedent tidligere beskrevet flow flowcytometri11, viste betydelig variation inden for kartoffel slægtninge, kultivarer og væv16 . Her præsenterer vi protokollen i detaljer ved at evaluere EI i sammenhænge Ploidi, væv og knold størrelse.
Den protokol, der præsenteres heri giver forskere med et middel til at vurdere endoreduplikation i kartoffelknolde, hvis modificerede cellulære indhold og øget celle størrelse tilsyneladende udelukker andre flow flowcytometri præparater. Protokollen er afhængig af protoplast generation som et middel til at reducere støj og snavs samtidig opretholde nukleare integritet. Tidligere har forskere beskrevet lignende præparater til særligt genstridige flow flowcytometri prøver samt udnyttet knold protoplasts for at studere en bred vifte af emner såsom patogenese19,20. Men til vores viden, har ingen kombineret brug af sådanne knold protoplasts med flowcytometri at studere endoreduplikation. Derudover fandt vi brugen af protoplasts til at være mere pålidelige end typiske rå præparater samt teknikken udnyttede i to kun andre undersøgelser for at vurdere knold endoreduplikation6,7. Her diskuterer vi mangler protokollen, potentielle faldgruber i sin udførelse og prøve forberedelse, og resultaterne af en typisk eksperiment, der beskæftiger det.
Trods den nytte og repeterbarhed af knold flow flowcytometri protokol har det et par svagheder, som bør drøftes. Til at begynde, er protokollen tid intensiv, der kræver to overnight inkubationer. Derudover kræver protokollen nogle dyre reagenser, især cellulase og macerozyme. Derudover er forberedelserne meget tidsfølsomme, nedværdigende inden for et par timer, som kan begrænse produktion inden for en enkelt dag, især hvis mange arrangementer er ønsket. Endelig, protokollen, mens pålidelige, er følsom over for fejl inden for prøveforberedelse som alle synes at medføre skade på kerner og lavere kvalitetsresultater. For eksempel, kan mikrobiel kontaminering opstå under plasmolysis og protoplast generation trinene (1-3,4) på grund af forkert aseptisk teknik. Prøven forurening, mens ikke altid udelukker succes af en prøve, synes at dramatisk reducere kvaliteten af opnåede histogrammer, skyldes igen sandsynligvis skade til atomkerner.
Som tidligere nævnt er de store ulemper ved protokollen omkostninger, tid og følsomhed over for fejl. Forskere kan ønske at tage skridt til at afbøde hver af disse. Hvad angår omkostninger, forskere har til hensigt at anvende protokollen at mange prøver kan overveje at ændre enzym koncentrationer og/eller varighed af fordøjelsen skridt som forskellige væv og genotyper kan variere i lydhørhed. Dette omfatter muligheden for filtrering og genanvendelse den ES, som tidligere har været vist men ikke ansat her21. Med hensyn til tid, i vores observation, er det muligt at give afkald på den første inkubation (plasmolysis trin) og stadig uddrag protoplasts; dog, deres integritet og overflod vil lide, der negativt påvirker resultaterne. For at mindske forringelse af prøver skønner forskere, at nogle flow flowcytometri metoder indebærer brug af fikseringsmidler (fx formaldehyd) at bevare prøve integritet22. Dette kan være et nyttigt middel til både forebygge forringelse og giver mulighed for prøve opbevaring snarere end protoplast International og flow flowcytometri forekommer på samme dag som præsenteres. Et andet middel til at forebygge nedslidning af kerner kan være at inkludere en nukleasen hæmmer ES og/eller FBC; mens 2-mercaptoethanol foretages ingen mærkbare ændringer under udvikling, er andre hæmmere ikke blevet testet heri.
I vores observation er det mest afgørende skridt skridt 4.4, fjernelse af alle plasmolysis vaskeopløsning før tilsætning af flow flowcytometri buffer (FCB). Hvis selv en lille mængde (< 10 µL) rester, prøver er meget mere tilbøjelige til at blive forringet, hvilket kan føre til en dårlig eller endda mislykket prøve. Dette er sandsynligvis på grund af urenheder i enzym løsning (f.eks. nukleaser, proteaser)23,24 , der hurtigt nedbrydes atomkerner under inkubation perioder og tid mellem prøve kører, selv ved lave koncentrationer. En anden vigtig overvejelse er varigheden af PI og RNase inkubation trin. Som det fremgår af protokollen, forbliver prøverne ikke stabil i mere end et par timer efter tilsætning af FCB så forskere kan beslutte at nedsætte varigheden af disse trin til at rumme flere prøver eller langvarige flowcytometri kører som følge af lav kerner koncentrationer. Dette kræver også forsker til at overveje afvejningen mellem antallet af begivenheder pr. sample og samlede antal prøver at køre eller overveje brugen af fikseringsmidler som tidligere nævnt.
Forskelle mellem væv og genotyper
For at give resultater repræsentant i protokollen udviklet vi to simple eksperimenter for at bekræfte tidligere rapporteret variation af væv og undersøge Ploidi og genotype indflydelse. Resultaterne af væv eksperiment viser, at protokollen giver reproducerbare resultater, som sagopalmer væv blev igen fundet for at have den højeste EI. Noget overraskende parenkym væv, som ikke havde tidligere blevet evalueret, havde en EI værdi svarende til kortikale væv og betydeligt lavere end sagopalmer. Dette var uventede parenkym celler er typisk større end enten sagopalmer eller kortikale celler, i det mindste ved modenhed. En mulig forklaring er, at knolde (90-130 g) var alt for umoden til parenkym celler, som udgør størstedelen af knold volumen på modenhed, at have fuldt udvidet og nået deres maksimale C-værdierne25. Dette kan også forklare, hvorfor dihaploid (VT_SUP_19) og den fordoblet dihaploid (VT_SUP_19 4 x) vist betydeligt større EI end cv. Superior knolde; mens knolde af omtrent samme størrelse blev udtaget fra hvert genotype, er den maksimale størrelse af knolde fra enten VT_SUP_19 eller den isogene tetraploide meget mindre end stamfader. Det kan således være, at de vises større EI blot fordi de var større i forhold til deres maksimale opnåelige størrelse. Alternativt, forskellen kan være en følge af den genetiske supplement VT_SUP_19 modtaget fra sin tetraploide stamfader. En anden mulighed er, at den genomisk reduktion, der opstod på udvinding af dihaploid fra tetraploide kan have afsløret skadelige alleler resulterer i plante-plan stress, som også har vist sig at bidrage til forhøjede EI26. Dette viser dog nøje overvejelse forskere skal ansætte når du vælger knolde og væv bruges til sammenligning af EI værdier, især mellem genotyper.
Fremtidige ansøgninger
Den protokol, der er beskrevet i denne artikel giver forskere et vigtigt redskab til forståelse endoreduplikation i kartoffel. Det kan for studier i de genetiske og miljømæssige komponenter af endoreduplikation, tidsforløb for udvikling på tværs af knold væv og vurdering af naturlige variationer. I sidste ende kan endoreduplikation gøre en lovende mål for kartoffel forbedring, en virksomhed, der vil kræve et pålideligt middel til vurdering.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af National Science Foundation Award nummer 1237969, “Optrevling heterozygositet, allel sammensætning og Copy Number Variation af kartoffel” og USDA særlige tilskud 2014-34141-22266 (University of Maine) til RV.
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |