Her beskriver vi en protokol for at fastslå pulmonal svampe byrde i mus med invasiv aspergillose ved kvantificeringen af Gomoris modificerede methanamine sølvfarvning i histologiske sektioner. Brug af denne metode resulterede i sammenlignelige resultater med mindre dyr i forhold til vurdering af svampe byrde af kvantitativ PCR lunge svampe DNA.
Kvantitativ bestemmelse af lungen svampe byrde er afgørende for fastlæggelsen af de relative niveauer af immun beskyttelse og svampe virulens i musemodeller af pulmonal svampeinfektion. Selv om flere metoder bruges til at vurdere svampe byrde, er kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) af svampe DNA opstået som en teknik med flere fordele i forhold til tidligere kultur-baserede metoder. I øjeblikket, nødvendiggør en omfattende vurdering af lunge patologi, leukocyt rekruttering, svampe byrde og genekspression i mus med invasiv aspergillose (IA) brugen af et betydeligt antal af eksperimentelle og kontroldyr. Her blev kvantificering af lunge histologiske farvning for at bestemme svampe byrde ved hjælp af et reduceret antal dyr undersøgt i detaljer. Lunge sektioner var farvet for at identificere svampe strukturer med Gomoris modificerede methanamine sølv (GMS) farvning. Billeder blev taget fra afsnittene GMS-farvede fra 4 diskrete felter for hver formalin-fast paraffin-embedded lunge. GMS farvede områder inden for hvert billede blev kvantificeres ved hjælp af et billede analyse program, og fra denne kvantificering, den gennemsnitlige procentdel af farvede område blev fastlagt for hver enkelt prøve. Bruger denne strategi, faldt eosinofil-mangelfuld mus udstillet svampe byrde og sygdom med caspofungin terapi, mens wild-type mus med IA ikke gjorde det bedre med caspofungin. Ligeledes svampe byrde i mus mangler γδ T celler blev også forbedret af caspofungin, målt ved qPCR og GMS kvantificering. GMS kvantificering er derfor indført som en metode til bestemmelse af relativ lunge svampe byrde, der i sidste ende kan reducere mængden af forsøgsdyr kræves for omfattende undersøgelser af invasiv aspergillose.
IA er en opportunistisk infektion, der kan udvikle sig i modtagelige personer med medfødt eller erhvervet immun mangler på grund af immun suppressiv behandling eller kronisk infektion1,2. Primær infektion ofte forekommer i lungerne, men i nogle tilfælde formidling af Aspergillus fumigatus til leveren, nyrer, hjerte og hjerne kan forekomme, resulterer i omfattende væv invasion af hyfer ledsaget af alvorlige sygdomme og høje satserne for dødelighed1,2. Desuden, effekten af eksisterende pharmacotherapies er begrænset, og kan blive yderligere svækket af fremkomsten af svampemidler-resistente bakteriestammer i miljøet3. Det er derfor vigtigt at forstå de mekanismer i svampe virulens og vært patologi, der fremmer udvikling eller forværring af invasive svampesygdom.
Murine modeller er fortsat vigtig for mekanistisk IA undersøgelser, som de tillader forskere til at vurdere rollerne af svampe virulens gener og vært immun effektorer for oprettelse og vækst af A. fumigatus in vivo4,5. Derfor har flere strategier været udtænkt for at effektivt kvantificere eller sammenligne svampe byrde i grupper af forsøgsdyr6,7. Disse strategier indebærer kultur-baseret, biokemiske, immunoassay eller qPCR metoder, hver med forskellige fordele og ulemper. Desuden, hver af disse metoder indebærer ved indvielsen af en delmængde af dyr end dem, der ofrede for vurderinger af immun effektor funktion, gene expression analyse og sammenlignende histopatologi7. Således kræver omfattende IA undersøgelser ofte betydeligt antal forskning dyr med betydelige omkostninger. Effektive strategier, der reducerer eksperimentelle tid, animalsk omkostninger og etiske overvejelser ved at udnytte dyrevæv for flere analyser er derfor meget værdifulde7.
I denne betænkning, er en metode, der beskriver kvantificering af GMS farvning i histologiske sektioner for sammenligning af den relative svampe byrde mellem eksperimentelle grupper af mus med IA indført. Hvert trin fra svampe kultur infektion, væv høst og forarbejdning, og image erhvervelse og dataanalyse, er beskrevet i detaljer. Svampe byrder fremstillet ved GMS kvantificering blev sammenlignet med qPCR neutropenisk modeller af IA og caspofungin-behandlede wild-type eller eosinofil-mangelfuld mus med IA8. Resultaterne vis lighed med GMS kvantificering og qPCR svampe DNA. Dette tyder på, at GMS kvantificering kan være nyttigt at forskere involveret i histologiske analyser som en supplerende eller alternative metode til sammenligning af relative svampe byrde i mus med IA, og kan i sidste ende reducerer omkostningerne og anvendelse af forskning dyr i komplekse, Mekanistiske undersøgelser.
Formålet med denne artikel var at indføre en metode til bestemmelse af lungen svampe byrde i mus med IA ved at udnytte GMS-farvede lunge histologiske sektioner til billedanalyse og kvantificering. I denne undersøgelse, behandling med β-glucan-syntese-målretning svampedræbende medicin caspofungin14 ikke bedre overlevelse eller svampe byrde i neutropenisk wild-type mus med IA8. Men, i mangel af eosinofile eller γδ T celler, overlevelse og svampe byrde forbedret. Resultaterne af vores undersøgelse viste også, at sammenlignelige resultater kan opnås ved GMS svampe byrde i forhold til den udbredte svampe DNA qPCR metode6.
Der er flere fordele ved at udnytte GMS svampe byrde kvantificering. Først, processen kan udnytte eksisterende histologiske prøver, dermed potentielt reducere antallet af eksperimenter skal bestemme betydelige forskelle. For det andet i denne undersøgelse var mindre dyr nødvendige for GMS svampe byrde kvantificering at opnå betydelige forskelle i forhold til qPCR svampe DNA (figur 6, figur 7). For det tredje, sammenligning af svampe byrde i forskellige isolater af qPCR kan blive påvirket af isolatet-afhængige forskelle i ribosomale DNA kopi nummer15. Derimod er GMS kvantificering ikke berørt af eksemplarnummer, som svampe byrde er bestemt af relative niveauer af lunge svampevækst. Således brug GMS bestemmelsesgrænsen for svampe byrde reducerer brugen af hvirveldyr og kræver ikke før bestemmelse af rDNA kopi nummer. Endelig, ud over at ændre svampe morfologi, caspofungin terapi øger svampe opsplitning, og dermed kan kunstigt øge svampe byrde målt ved isolering af kolonien danner enheder fra lunge homogenater12,16 ,17. Således undgår GMS kvantificering af svampe byrde flere begrænsningerne med andre almindeligt anvendte metoder.
Begrænsningerne i GMS kvantificering og/eller denne undersøgelse er imidlertid vigtigt at bemærke. Først, forfatterne antaget en tilsvarende fordeling af hyphal vækst i hele lungerne af hver eksperimentelle gruppe, og dermed bruges kvantificering fra 4 repræsentant 10 x objektive felter som en repræsentativ måling for svampe byrden i hele lungen (Fig. 6B). Det er muligt, at i nogle tilfælde relative fordeling, størrelse og tæthed af hyphal foci ville tilstrækkeligt adskiller sig så at den svampe byrde ville vises anderledes med denne metode og tilsvarende af metoden qPCR. Men vores yderligere resultater med hele lunge afsnit kvantificering ved hjælp af 4 X objektive felterne viste lignende, omend mindre statistisk signifikante forskelle mellem grupperne (figur 6 c). Standardafvigelsen på denne kvantificering blev forøget med denne strategi, sandsynligvis på grund af nedsat hyphal opløsning med 4 X mål og øget baggrund i suboptimal felter. Derfor foretrækkes en repræsentative kvantitativ bestemmelse af færre felter på højere forstørrelse. For det andet blev kun en enkelt, central del brugt til hver prøve. Det er muligt, baseret på de svampe isolater eller mus stammer anvendes, at nogle undersøgelser kan resultere i en ujævn fordeling af hyphal vækst. I disse tilfælde bør yderligere sektioner i hele hver paraffin blok kvantificeres for at opnå et mere repræsentativt byrde. For det tredje i eksperimenter, der inducerer betydelig produktion af Muciner (dvs.kvantificering luftvejene svampevækst i allergiske bronchopulmonary aspergillose (ABPA)18 eller cystisk fibrose (CF)18), GMS reaktivitet med polysakkarid-rige Muciner19 kunne give uspecifikke GMS + resultater og dermed forvrænge nogle prøver til fordel for højere svampe byrde. Da kun neutropenisk modellen af IA blev brugt i denne undersøgelse, er det muligt, at brugen af andre immun kompetente eller undertrykkende modeller kunne resulterer i mindre sammenlignelige resultater. Trods disse forbehold, GMS kvantificering giver en lignende teknik til at bestemme svampe byrde, og dens fortsatte brug i supplerende undersøgelser kan yderligere validere nytten af denne metode som konsekvent, pålidelig og omkostningseffektiv.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse var delvist understøttet af en Indiana University skole af medicin forskning Enhancement Grant og af NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. blev delvis støttet i denne periode af en karriere i immunologi Fellowship fra American Association for Immunologists.
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |