A Turbellaria mediterranea Schmidtea é um excelente modelo para o estudo de células-tronco e regeneração de tecidos. Esta publicação descreve um método para remover seletivamente um órgão, a faringe, expondo os animais para a química de azida sódica. Este protocolo também descreve métodos para monitorar a regeneração da faringe.
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Artigo de método
Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea
Neste artigo
Resumo
Resumo
Boca é platelmintos que são extremamente eficientes em regeneração. Eles devem esta capacidade a um grande número de células-tronco que podem responder rapidamente a qualquer tipo de lesão. Modelos de lesões comuns nestes animais remover grandes quantidades de tecido, que danifica a vários órgãos. Para superar este dano de tecido largo, descrevemos aqui um método para remover seletivamente um único órgão, a faringe, na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Conseguimos isso por animais de imersão em uma solução contendo o citocromo oxidase inibidor de azida sódica. Breve exposição a azida de sódio provoca extrusão da faringe do animal, que chamamos de "amputação química." Amputação química remove a faringe inteira e gera uma pequena ferida onde a faringe anexa para o intestino. Após enxaguar extensa, todos os animais amputados regeneram uma faringe totalmente funcional em cerca de uma semana. Células-tronco no resto do corpo conduzir a regeneração da faringe nova. Aqui, nós fornecemos um detalhado protocolo para amputação de química e descrever métodos histológicos e comportamentais para avaliar o sucesso amputação e regeneração.
Introdução
Regeneração é um fenômeno que ocorre em todo o reino animal, com capacidades regenerativas de regeneração de corpo inteiro em certos invertebrados para habilidades mais restritas em vertebrados1. Substituição de tecidos funcionais é um processo complexo e muitas vezes implica a restauração simultânea de vários tipos de células. Por exemplo regenerar o membro salamandra, osteoblastos, condrócitos, neurônios, músculos e células epiteliais precisa ser substituído2. Estes tipos de células recém-gerado também precisam ser organizado corretamente, para facilitar a nova função de membro. Compreensão destes processos complexos r....
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Protocolo
1. preparação
-
Preparação da água de planária 17
- Manter a boca em uma solução de sal de X Montjuïc 1. Para preparar Turbellaria água, certifique-se soluções de ações individuais de 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M NaCl em água ultrapura. Filtro-esterilizar com um armazenamento de longo prazo de garrafa-top filterfor de 0,2 µm.
Nota: Use apenas água desionizada ultrapura (com uma resistividade de 18,2 MΩ a 25 ° C) para preparar Montjuïc sais. - Para preparar um estoque de 1 L de solução de sal de 5 X, combinam-se 5 mL de 1 M CaCl2
- Manter a boca em uma solução de sal de X Montjuïc 1. Para preparar Turbellaria água, certifique-se soluções de ações individuais de 1 M CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M NaCl em água ultrapura. Filtro-esterilizar com um armazenamento de longo prazo de garrafa-top filterfor de 0,2 µm.
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Resultados
Exposição a azida de sódio interrompe a motilidade normal da boca, fazendo com que os animais se esticar e se contorciam. Estes movimentos forçar a faringe que emergem do lado ventral do animal, e após aproximadamente 6 min em solução de azida de sódio, a ponta branca da faringe pode ser vista (figura 1B-painel esquerdo). Poucos minutos depois, os animais ativamente contraem e estendem totalmente a faringe, empurrando-o com força fora do corp.......
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Discussão
Este protocolo descreve um método da ablação seletiva da faringe usando a azida de sódio. Outros estudos de ablação alvejado na boca têm usado modificada cirurgia para remover fotorreceptores21 ou tratamento farmacológico para ablação de neurônios dopaminérgicos22. Uma vantagem significativa de amputação química sobre os métodos existentes é que não requer cirurgia. A estrutura rígida da faringe em comparação com o resto do corpo Turbellaria facilita a sua remoção completa .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Alejandro Sánchez Alvarado, que apoiaram a otimização inicial e desenvolvimento desta técnica. Trabalho no laboratório de Carolyn Adler é suportado por fundos de start-up da Universidade de Cornell.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de Cálcio Di-hidratado (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuï c solução salina |
| Sulfato de magnésio anidro (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuï c solução salina |
| Cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuï c solução salina |
| Cloreto de potássio (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuï c solução salina |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuï c solução salina |
| Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuï c solução salina |
| Nalgene copolímero de polipropileno autoclavável lowboy com torneira | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Armazenamento de água planária |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Picar fígado |
| Sacos de confeitaria descartáveis-16", pacote de 12 | alíquotas de fígado | Wilton | Amazon |
| Seringas de 5 mL | BD/VWR | 309647 | alíquotas de fígado |
| placas de Petri-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Recipientes de plástico (vários tamanhos) | Ziploc | Amazon | Habitação planárias em cultura estática |
| Azida de | sódio Sigma | Pipeta de transferência S2002 | |
| Pinça Globe Scientific | 138030 | ||
| - Pinça Dumont, Estilo 5 | Microscopia Eletrônica Ciências | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugado | ThermoFisher | S11223 | |
| Glicerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
Referências
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M.
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Reimpressões e permissões
