Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea
Summary
De planarian Schmidtea mediterranea is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcellen en weefselregeneratie. Deze publicatie beschrijft een methode om selectief verwijderen van één orgaan, de keelholte, door dieren naar de chemische natriumazide bloot te leggen. Dit protocol wordt ook uitgelegd welke methoden voor de controle van de keelholte regeneratie.
Abstract
Planarians zijn platwormen die uiterst efficiënt bij regeneratie zijn. Ze zijn verplicht deze mogelijkheid om een groot aantal cellen van de stam die snel op elke vorm van schade inspelen kunnen. Gebruikelijke letsel modellen met deze dieren verwijderen grote hoeveelheden weefsel, die meerdere organen aantast. Om te overwinnen deze brede weefselschade, beschrijven we hier een methode voor het selectief verwijderen van een enkel orgaansysteem, de farynx, in het planarian Schmidtea mediterranea. Dit bereiken we door inweken dieren in een oplossing met de cytochroom oxidase remmers natriumazide. Korte blootstelling aan natriumazide veroorzaakt extrusie van de keelholte van het dier, wat wij noemen “chemische amputatie.” Chemische amputatie worden verwijderd van de gehele farynx en genereert een kleine wond waar de farynx aan de darm hecht. Na het uitgebreide spoelen, regenereren alle geamputeerde dieren een volledig functionele keelholte in ongeveer een week. De cellen van de stam in de rest van het lichaam rijden regeneratie van de nieuwe farynx. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol voor chemische amputatie, en beschrijven van zowel histologische en gedragsmatige methoden om succesvolle amputatie en regeneratie te beoordelen.
Introduction
Regeneratie is een verschijnsel dat zich voordoet in het dierenrijk, met regeneratieve capaciteiten van volledige lichaam regeneratie in bepaalde ongewervelde dieren tot meer beperkte capaciteiten in gewervelde dieren1. Vervanging van functionele weefsels is een complex proces en vaak met zich meebrengt het gelijktijdige herstel van meerdere celtypen. Bijvoorbeeld om te regenereren de salamander ledemaat, botcellen chondrocyten, neuronen, spieren en epitheliale cellen moeten worden vervangen2. Deze nieuw gegenereerde celtypes moeten ook goed worden georganiseerd om nieuwe functie van de ledematen. Inzicht in deze complexe processen vereist technieken die gericht zijn op herstel van bepaalde celtypen en hun integratie in de organen.
Een van de strategieën ter vereenvoudiging van de studie van regeneratieve reacties in dienst is de gerichte ablatie van hetzij bepaalde celtypen of grotere collecties van weefsels. Bijvoorbeeld, in zebrafish leidt uitdrukking van nitroreductase in specifieke celtypen tot hun vernietiging na toepassing van metronidazol3,4. In Drosophila larven, het uiten van pro-apoptotic genen onder weefsel-specifieke initiatiefnemers bepaalde regio’s van de imaginaire schijf5,6selectief lasertherapie. Beide van deze strategieën snelle, maar gecontroleerde schade veroorzaken, en zijn gebruikt voor het ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de regeneratie.
In dit manuscript beschrijven we een methode voor selectief lasertherapie een gehele orgaan de farynx in de planarian Schmidtea mediterraneagenoemd. Planarians zijn een klassieke model van regeneratie, bekend voor hun productieve regeneratieve vermogen, waar zelfs minieme fragmenten kunnen regrow hele dieren 7,8. Ze hebben een grote, heterogene populatie van stamcellen uit zowel pluripotente cellen en lineage-beperkte progenitoren9,10,11. Deze cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken ter vervanging van alle ontbrekende weefsel, met inbegrip van de keelholte, zenuwachtig, spijsvertering en uitscheidingsmechanisme systemen, en spier- en epitheliale cellen9,10,12. Terwijl we weten dat deze stamcellen regeneratie start, doen we de moleculaire mechanismen die hen ter vervanging van al deze verschillende soorten cellen rijden niet volledig begrijpen. Gedefinieerde verwonden methoden die de cel van de stam van de precieze antwoorden ontlokken kunnen helpen dit complexe proces af te bakenen.
De keelholte is een grote, cilindervormige buis die nodig zijn voor het voederen en neuronen, spier, epitheliale en secretoire cellen13,29bevat. Normaal gesproken verborgen in een tasje aan de ventrale zijde van het dier, het strekt zich uit door één lichaam van het dier openen na detectie van de aanwezigheid van voedsel. Om selectief amputeren de farynx, genieten we planarians in een chemische genaamd natriumazide, een veelgebruikte verdoving in C. elegans14,15,16. Het gebruik ervan in planarians werd voor het eerst gemeld door Adler et al.., in 201412. Binnen enkele minuten van de blootstelling aan natriumazide planarians extruderen hun pharynges, en met zachte agitatie, de keelholte is losgekoppeld van het dier. We verwijzen naar dit complete en selectieve verlies van de keelholte als “chemische amputatie”. Een week na amputatie, is een volledig functionele farynx gerestaureerde12. Omdat de farynx vereist wordt voor het voederen, kan functionele regeneratie worden gemeten door voeding werking te controleren. Hieronder beschrijven we het protocol voor chemische amputatie, en voor de beoordeling van de regeneratie van de farynx en restauratie van het voederen van gedrag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor selectief ablatie van de farynx met behulp van natriumazide. Andere gerichte ablatie studies in planarians hebben gemodificeerde chirurgie tweedehands voor wegnemen researchdieren21 of farmacologische behandeling lasertherapie Dopaminerge neuronen22. Een belangrijk voordeel van chemische amputatie over bestaande methoden is dat het vereist geen chirurgie. De rigide structuur van de farynx vergeleken met de rest van het lichaam planar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Alejandro Sánchez Alvarado, die zich aansluit bij de eerste optimalisatie en de ontwikkeling van deze techniek. Werk in Carolyn Adler van laboratorium wordt ondersteund door Cornell University start-up middelen.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
Referências
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
