Denne artikel beskriver detaljerede protokoller for økosystemet fabrikation af enheder (EcoFABs) som giver studier af planter og plante-mikrobe interaktioner i stærkt kontrollerede laboratorieforhold.
Positive plante-mikrobe interaktioner tilbyder en bæredygtig biologisk løsning med potentiale til at øge produktionen af lav-input mad og bioenergi. En bedre mekanistisk forståelse for disse komplekse plante-mikrobe interaktioner vil være afgørende for at forbedre planteproduktion, som godt som udfører grundlæggende økologiske undersøgelser behandlende anlæg-jord-mikrobe interaktioner. Her, er en detaljeret beskrivelse af økosystemet fabrikation præsenteret, bruger bredt tilgængelige 3D udskrivning teknologier, for at skabe kontrolleret laboratorium levesteder (EcoFABs) til Mekanistiske undersøgelser af plante-mikrobe interaktioner inden for specifikke miljømæssige betingelser. To størrelser af EcoFABs er beskrevet der egner sig til undersøgelse af mikrobielle interaktioner med forskellige plantearter, herunder Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum. Disse gennemstrømnings-enheder tillader kontrolleres manipulation og prøvetagning af roden microbiomes, root kemi samt imaging root morfologi og mikrobielle lokalisering. Denne protokol indeholder detaljer for at opretholde sterile forhold inde i EcoFABs og montering af uafhængige LED lys systemer på EcoFABs. Detaljerede metoder til tilføjelse af forskellige former for medier, herunder jord, sand, og flydende vækst medier koblet til karakterisering af disse systemer ved hjælp af billedbehandling og metabolomics er beskrevet. Sammen, disse systemer aktiverer dynamisk og detaljerede undersøgelser af plante- og plante-mikrobe konsortier herunder manipulation af microbiome sammensætning (herunder mutanter), overvågning af plantevækst, roden morfologi, ekssudat sammensætning, og mikrobielle lokalisering under kontrollerede miljøbetingelser. Vi forventer, at disse detaljerede protokoller vil tjene som et vigtigt udgangspunkt for andre forskere, ideelt at hjælpe oprette standardiserede eksperimentelle systemer for at undersøge plante-mikrobe interaktioner.
Anvendelsen af gavnlige plante mikrober i landbruget tilbyder store muligheder for at øge bæredygtig fødevareproduktion og biobrændstofproduktion at fastsaette en voksende befolkning1,2,3,4. En betydelig mængde af arbejde understøtter vigtigheden af at plante microbiomes i anlægget næringsstof optagelse, tolerance over for belastninger, og resistens over for sygdom5,6,7,8. Det er imidlertid vanskeligt at undersøge disse mekanismer af plante-mikrobe interaktioner i feltet økosystemer på grund af kompleksiteten og tilknyttede irreproducibility og manglende evne til at netop kontrol microbiome sammensætning og Genetik (fx., ved hjælp af mikrobielle mutanter)4,9,10.
Én strategi er at konstruere forenklet model økosystemer til at aktivere kontrolleret, replikerede laboratorieforsøg undersøger plante-mikrobe interaktioner for at generere indsigt, der kan blive yderligere testet i felt10,11, 12. Dette koncept bygger på traditionelle tilgange ved hjælp af planter, der dyrkes i jord-fyldt Potter eller på agar plader i drivhuse eller væksthuse13. Selv om disse sandsynligvis vil forblive mest anvendte metoder, de mangler evnen til at netop overvåge og manipulere plante vækst miljøer. Til disse formål, rhizoboxes og rhizotrons udgør en væsentlig forbedring i evnen til at studere under jorden processer14,15, og første protokoller blev offentliggjort til at analysere rhizosfære metabolitter i jordbunden16. For nylig, for at aktivere høj overførselshastighed analyse, avancerede mikrofluid enheder13,17 plante Chip18,19, RootArray20og RootChip21, har været udviklet som effektive værktøjer for anlægget fænotyper med mikrometer skala rumlige opløsning til at overvåge de tidlige vækst stadier af lille model planten Arabidopsis thaliana i flydende flow medium. For nylig, en to-lags imaging platform blev beskrevet som gør det muligt for root hår billeddannelse af Arabidopsis thaliana på sætteplante fase med en mikrofluid platform22.
Her, er detaljerede protokoller til at konstruere kontrolleret laboratorium udstyr (EcoFABs) forudsat for at studere plante mikrobe interaktioner og vise at de kan bruges til at studere forskellige planter herunder Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, de økologisk vigtige flyvehavre Avena barbata, og bioenergi afgrøde Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB er et sterilt plante vækst platform, der omfatter to primære komponenter: EcoFAB enhed og steril plante mellemstore gennemsigtig beholder. EcoFAB enhed er lavet af en Polydimethylsiloxan (PDMS) fremstillingsprocessen, der indebærer støbning PDMS lag fra en 3D trykte plast skimmel og limning PDMS lag på objektglas med metoder tidligere rapporteret24,25 . De detaljerede procedurer for EcoFAB arbejdsgang, som enheden fabrikation, sterilisation, frø spiring, sætteplante transplantation, mikrobe podning/cocultivation, forberedelse af prøver og analyse, er beskrevet i denne protokol (figur 1). Yderligere ændringer af den grundlæggende arbejdsgang er beskrevet, herunder installation af computeren kontrolleret LED vokse lys og udnyttelse af fast underlag. Udnyttelsen af imaging teknikker til at undersøge root morfologi ændres, mikrobiel kolonisering af rødder, og masse spektroskopiske billeddannelse af roden ekssudater er beskrevet. Vi forventer, at den nemme, prisbillige design baseret på let tilgængelige materialer, samt de detaljerede protokoller, der præsenteres her, vil gøre EcoFAB platform til et samfund indtægt, standardisere plante-microbiome laboratorieundersøgelser.
Protokollerne rapporteret her anvende økosystem fabrikation til at oprette EcoFABs giver Fællesskabets ressourcer til systematisk plante biologiske undersøgelser i stærkt kontrollerede laboratorieforhold. Forskud i 3D-printning give bredt tilgængelige teknologier for opbygningen og iterativt raffinering EcoFAB designs. Roden salen præsenteres her er fundet for at være velegnet til imaging mikroskopi og vedligeholdelse af steriliteten, gør det muligt for kontrolleret tilsætning af mikrober til at undersøge plante-mikrobe interaktioner. EcoFAB-platformen er kompatibel med forskellige plantearter. Det er vigtigt at anerkende fysiologiske effekter af dyrkning af planter i smalle root kammeret, således at yderligere eksperimenter vil være forpligtet til at generalisere resultaterne til planter, der vokser i naturlige miljøer.
Brug af sterile kamre og LED grow lys gør det muligt for undersøgelse af virkningerne af forskellige lysforhold, herunder bølgelængde, intensitet og varighed, på planternes vækst og tilhørende fysiologiske parametre parallelt. Vendbar limning root kamre tillade brug af fast underlag samt om rumligt indsamle solid prøver for biokemiske og genetiske analyser. Anvendelser af solid substrater, såsom jord, sand og kvarts perler, tilbyde mulighederne for at anvende EcoFABs til at konstruere mere økologisk relevante laboratorium økosystemer. Men alle de systemer, der er præsenteret her brug mættet væske (hydroponiske kulturer), som ikke er en præcis afspejling af de fleste jorder, og det vil være vigtigt at yderligere forfine disse designs at opretholde luftlommer i jorden, således at de bedre repræsenterer naturlige jordbund.
Brug af både enkle kameraer og mikroskoper er beskrevet til billede rodsystem morfologi udvikling på både bulk til cellulære niveau. Denne egnethed til overvågning root morfologi billedbehandling og kvantificering vil sandsynligvis være nyttige for at forstå reguleringsmekanismer plante fysiologiske og molekylære signaler udløst af plante genotypiske tilpasninger til vækstbetingelser. En begrænsning for at studere fysiologiske rodudvikling er imidlertid den aktuelle vandrette placering af EcoFAB enhed. I naturlige miljøer fører rødder gravitropic svar til en overvejende lodret udvikling af rodsystemet. Således, den horisontale system præsenteres her sandsynligvis adskiller sig på nogle faktorer fra et naturligt miljø, og fabrikation af EcoFAB systemer med lodrette placering af roden salen er et ønskværdigt mål for fremtidige EcoFAB versioner. Selv om de nuværende EcoFAB enheder er placeret vandret, er analyse af roden morfologi parametre i forskellige betingelser, eller som svar på mikrober, muligt. Høj opløsning imaging kan anvendes til at fange root kolonisering dynamics enkelt isolater eller samfund, oplysning om hvilken plante dele er koloniseret i forskellige næringsstoffer tilstrækkelig og mangelfuld betingelser. Det forventes, at sådanne studier giver vigtig ny indsigt i hvordan plante microbiomes er samlet, og hvordan disse dynamikker ændres over tid, for eksempel som rødderne udvikle.
Mikrofluid enheder aktiverer billeddannelse af meget unge planter, og mængden af metabolitter indsamlet er normalt ikke tilstrækkeligt for LCMS analyse. Jord-baserede systemer, såsom rhizotrons, tillade billeddannelse af roden morfologi, når enten planterne er transformeret med kemiluminescens konstruktion (Glo-root) eller med NMR-baseret metoder33,34. Metabolit ekstraktioner fra disse systemer er tidskrævende på grund af stort antal prøver. EcoFABs er en kombination af begge dele: fabrikation er svarende til mikrofluid enheder. EcoFABs var designet til at være enkel og billig at reproducere, men størrelsen af kammeret kan justeres for at dyrke planter med små eller store rodsystemer, op til deres reproduktive faser. Samtidige observationer af roden morfologi ændringer og root udsondring er muligt. Systemet er sterile, gør det muligt for kontrolleret tilsætning af specifikke mikrober.
EcoFABs er designet til at muliggøre kontrolleret indførelse og prøveudtagning af mikrober og metabolitter. Specifikt, er prøver, der opsamlet fra rod vækst kamre fundet for at være tilstrækkelig for masse spektroskopiske metabolit profilering. Integration af massespektrometri imaging (fx., NIMS teknik præsenteres her) giver en ikke-destruktiv tilgang for at studere metabolit rumlige distributioner af rodsystemer. Denne teknik vil sandsynligvis være nyttigt i fremtidige stabil isotop sporing eksperimenter og kortlægning mikrobielle lokalisering til specifikke metabolitter36. Mens denne protokol har fokuseret på enkelt isolater, kan den samme design helt sikkert bruges til mere komplekse samfund. Prøven diskenheder og biomasse inden for EcoFABs er sandsynligvis mere end tilstrækkelig for yderligere integration med DNA-sekventering teknologier, som vil være vigtigt at karakterisere og overvåge mikrobielle samfund struktur og gen udtryk.
Til sidst, denne protokol detaljer fabrikation laboratory økosystemers designet til undersøgelse af plante-mikrobe interaktioner, med vægt på enkle og tilgængelige metoder, der let kan gennemføres og udvides af forskere omkring den verden. Nuværende bestræbelser har til formål at demonstrere reproducerbarhed mellem labs og integration af en temperaturregulator sådan, at hver EcoFAB vil have uafhængigt kontrolleret lys og temperatur. Et yderligere fremskridt af systemet vil være integration af automatiske prøvetagning og genpåfyldning af EcoFAB root kamre og udviklingen af reproducerbare protokoller til oprettelse af relevante plante microbiomes inden for EcoFABs.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af laboratoriet instrueret forskning og udvikling (LDRD) program af Lawrence Berkeley National Laboratory støttet af Office of Science, af det amerikanske Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231 og en pris DE-SC0014079 fra den amerikanske afdeling af energi Office of Science til UC Berkeley. Arbejde på den molekylære Foundry blev støttet under US Department af energi Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Vi takker også Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen og Benjamin J. Cole ved Lawrence Berkeley National Laboratory for al deres hjælp.
3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
Ethanol | VWR | 89125-172 | |
Bleach | |||
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |