Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay
Summary
Этот документ представляет собой всеобъемлющую процедуру для оценки в vitro классические опухоли ангиогенеза существует ли в гемангиобластомы (ХБС) и его роль в ОБД. Результаты подчеркивают сложность HB-неоваскуляризации и предполагают, что эта распространенная форма по ангиогенез только дополнительный механизм в HB-неоваскуляризации.
Abstract
Инактивации ген-супрессор опухолевого фон Хиппель-Линдау (ВХЛ) играет решающую роль в развитии гемангиобластомы (ХБС) внутри человека центральной нервной системы (ЦНС). Однако цитологические происхождения и процесс эволюции HBs (включая неоваскуляризация) остаются спорными, и анти ангиогенеза для ВХЛ-HBs, основанный на классической HB ангиогенеза, дали неутешительные результаты в клинических испытаниях. Одним из основных препятствий для успешной клинической перевод анти сосудистой лечения является отсутствие глубокого понимания неоваскуляризация в этом сосудистые опухоли. В этой статье мы представляем всеобъемлющей процедуры для оценки в vitro классические опухоли ангиогенеза существует ли в ОБД, а также его роль в ОБД. С этой процедурой исследователи могут точно понять сложность HB неоваскуляризации и определить функции этой распространенной формой ангиогенеза в ОБД. Эти протоколы могут использоваться для оценки наиболее перспективных анти сосудистой терапии опухолей, который имеет высокий трансляционная потенциал для лечения опухоли либо пособничество в оптимизации лечения анти ангиогенных HBs в будущем переводы. Результаты подчеркивают сложность HB неоваскуляризации и предположить, что это общие формы ангиогенез-это только дополнительный механизм в HB неоваскуляризации.
Introduction
Гемангиобластомы (ХБС) являются доброкачественные сосудистые опухоли, которые находятся исключительно в пределах человека центральной нервной системы (ЦНС). Они развиваются в больных с фон Хиппель-Линдау (ВХЛ) болезни или спорадические поражений. ВХЛ-HBs трудно вылечить путем хирургического лечения из-за частого повторения и несколько поражений, которые в результате этого генетические расстройства1. Хотя инактивации ген-супрессор опухолевого ВХЛ рассмотрел причины tumorigenesis ВХЛ-HBs, цитологические происхождения (включая неоваскуляризация) и эволюционного процесса HBs остаются во многом спорные2. Поэтому лучшее понимание биологических механизмов HB-неоваскулярной может дать полезную информацию в наиболее перспективных анти сосудистой стратегии для ВХЛ-HBs.
Недавние исследования показали, что HB-неоваскуляризация похож на эмбриологических vasculogenesis3,4,5. Классический Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)-опосредованной ангиогенеза, возникла из эндотелия и что движет ВХЛ потеря функции привело к распространению и формирование неоваскулярной, которая была оспорена6. В 1965 году, Cancilla и Циммерман найдена, с помощью электронной микроскопии, что ХБС возникла из эндотелия7. Позже было установлено, что стромальных клеток являются производными от vasoformative элемент8. В 1982 году Jurco et al. обнаружил, что стромальных клеток эндотелия происхождения9. Таким образом мы предположили, что человеческого сосудистой эндотелиальные клетки являются оригинальные клетки HB-неоваскуляризация10. Хотя это лучше использовать основной культуры от HB клеток, полученных от пациентов хирургии ВХЛ, наши предыдущие исследования указал, что основной культуры от HB не являются стабильными и клеточных линий не может быть установленным3. Кроме того основных культур в 3D среде не может опознать цитологического происхождения HB-неоваскуляризация потому, что они включают в себя родоначальниками HB-сосудистой ингредиенты10,11. Таким образом, как примитивные и классическая модель эндотелиальных клеток клеток человека сосудистого эндотелия (HUVEC) может служить альтернативной сотовой модели для HBs.
Прорастания пробирного сфероида представляет собой новую модель в ткани, инженерных12,13. В этом документе, 3D на основе коллагена coculture системы в пробирке с помощью сфероида прорастания пробирного была разработана, с общей целью оценить классические опухоли ангиогенеза существует ли в ОБД, а также его роль в ОБД.
Protocol
Representative Results
Discussion
Недавно несколько полей сосудистая биология исследований были простимулированы изучение ангиогенных эндотелия15. В этой статье, мы разработали эндотелиальной сфероида прорастания техника как экспериментальная модель для изучения формирования судна, что происходит от г?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от грантов от шанхайского комитета по науке и технике (15411951800, 15410723200). Авторы хотели бы поблагодарить профессора YuMei Вэнь и профессор Chao Чжао патогенного микроорганизма Департамента Фуданьский университет для их технической помощи.
Materials
| human umbilical vein endothelial cell | Fudan IBS Cell Center | FDCC-HXN180 | |
| dulbecco’s modified eagle’s medium | Gibco | 11995040 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 26400044 | |
| PLKO.1-puro vector | Addgene | #8453 | |
| packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 3D round-bottom 96-well plates | S-Bio | MS-9096M | |
| matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985-070 | reduced serum medium |
| 15-well plate | Ibidi | 81501 | Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight |
| endothelial cell growth supplements | Sciencell | #1052 | |
| 10-cm culture dish | Corning | Scipu000813 | |
| Puromycin | Gibco | A1113802 | |
| typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Automated Cell Counter System | BioTech | ||
| Image Analysis software | Winmasis | http://mywim.wimasis.com |
Referências
- Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
- Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist’s viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
- Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
- Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102 (2014).
- Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
- Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
- Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
- Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
- Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
- Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
- Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
- Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
- Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
- Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- D’Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).
- Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).
- Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
- Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
- Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
- Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
- Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
