Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo
Summary
Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l’imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l’invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l’efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.
Abstract
La sepsi è un tipo di infezione grave che può causare insufficienza d’organo e tessuto danni. Anche se i tassi di mortalità e morbilità associata a sepsi trattamento estremamente alto, nessun diretto o meccanismo di organo è stato esaminato in dettaglio in tempo reale. Il fegato è l’organo chiave che gestisce le tossine e le infezioni nel corpo umano. Nel presente documento, abbiamo mirato a eseguire imaging videomicroscopia del fegato del mouse dopo induzione di endotoxemia al fine di monitorare la motilità delle cellule immuni, quali neutrofili e macrofagi del fegato capsulari (LCMs). Di conseguenza, abbiamo progettato un nuovo metodo chirurgico per l’esposizione del fegato con la chirurgia mini-invasiva. Topi sono stati iniettati intraperitonealmente con il lipopolysaccharide (LPS), un comune dell’endotossina. Utilizzando il nostro nuovo approccio chirurgico per l’esposizione e l’imaging videomicroscopia del reclutamento del mouse del fegato, che abbiamo trovato che dei neutrofili in proteina fluorescente verde-LysM LPS-trattati (GFP) mouse del fegato è stato aumentato rispetto a quello in tampone fosfato fegato di salino-trattati. Dopo il trattamento LPS, il numero dei neutrofili è aumentato significativamente con tempo. Inoltre, con successo, utilizzando topi CX3Cr1-GFP, visualizzato macrofagi residenti del fegato chiamati LCMs. Pertanto, per studiare l’efficacia di nuovi reagenti per controllare la mobilità immuni in vivo, determinare la motilità e la morfologia dei neutrofili e LCMs nel fegato possono permetterci di identificare effetto terapeutico in organo fallimento e tessuto danni causati da attivazione di leucociti nella sepsi.
Introduction
Il fegato è l’organo metabolico principale nei mammiferi; Esso agisce come una torre di controllo per energia, ormoni e disintossicazione1. Grazie alla sua importanza, i ricercatori hanno condotto molti esperimenti in vitro e in vivo per delucidare i cambiamenti nel fegato durante l’infiammazione. La microscopia intravital è stata usata per catturare immagini in diretta dal fegato2 . Infatti, fegato vari metodi di formazione immagine sono stati introdotti2,3,4,5,6. Tuttavia, al fine di sviluppare un approccio chirurgico più semplificato e raggiungere la stabilizzazione dell’organo bersaglio e le cellule immunitarie, abbiamo progettato un semplice protocollo che possa guidare i ricercatori per ridurre al minimo il loro sforzo per videomicroscopia imaging.
In questo studio, abbiamo introdotto una camera di imaging stabile e romanzo e la tecnica chirurgica che possa essere utilizzata per ridurre al minimo il sanguinamento e possibili infezioni. Abbiamo confermato che il fegato è rimasta intatto per più di 2 h. Con questo metodo, abbiamo identificato correttamente morfologie di LCMs7 e neutrofili sotto condizione settica. Poiché questo metodo minimizza fisici e biologici fattori confondenti quali infiammazione tremante e imprevisto durante la procedura chirurgica, prevediamo che questo metodo potrebbe essere utilizzato per osservare le reazioni acute di cellule immunitarie nel fegato in risposta a i reagenti come LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il fegato è stato studiato attivamente da molti gruppi3,10, a causa dell’importanza della sua funzione. Per esempio, Heymann et al ha suggerito un metodo delicato utilizzando dell’agarosi. Anche se questo metodo è stato trovato per essere altamente precisi, l’impostazione di agarosio richiede tempo. Tuttavia, con la nostra metodologia, tutte le procedure possono essere effettuate entro 30 min, minimizzando altri fattori di confusione. In secondo luogo, il fegat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione dalla nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziata dal governo della Corea (MSIP; grant n. 2016R1A2B4008199 a Y-M. H.) e il Ministero della salute & benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
Referências
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
