एक तेजी से चांदी धुंधला प्रोटोकॉल एक गैर denaturing Polyacrylamide जेल का उपयोग कर एसएसआर मार्करों के सरल और कुशल का पता लगाने को सक्षम करने
Summary
यहां, हम रिपोर्ट एक सरल और कम लागत वाली रजत दाग प्रोटोकॉल है जो केवल तीन एजेंट और प्रसंस्करण के 7 मिनट की आवश्यकता है, और आनुवंशिक विश्लेषण में उच्च गुणवत्ता एसएसआर डेटा की तेजी से पीढ़ी के लिए उपयुक्त है ।
Abstract
सरल अनुक्रम दोहराने (एसएसआर) सबसे प्रभावी संयंत्र और पशु आनुवंशिक अनुसंधान और आणविक प्रजनन कार्यक्रमों में इस्तेमाल मार्करों में से एक है । चांदी धुंधला एक polyacrylamide जेल में एसएसआर मार्करों का पता लगाने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है । हालांकि, चांदी धुंधला के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से मांग कर रहे है और समय लेने वाली । कई अंय जैविक प्रयोगशाला तकनीक की तरह, चांदी के दाग प्रोटोकॉल तेजी से पता लगाने की क्षमता में सुधार करने के लिए अनुकूलित किया गया है । यहां, हम एक सरलीकृत चांदी धुंधला विधि है कि काफी एजेंट लागत कम कर देता है और पता लगाने के संकल्प और चित्र स्पष्टता को बढ़ाता है की रिपोर्ट । नई विधि दो प्रमुख कदम (गर्भवती और विकास) और तीन रिएजेंट (सिल्वर नाइट्रेट, सोडियम हीड्राकसीड, और formaldehyde), और एक गैर-denaturing polyacrylamide जेल के लिए प्रसंस्करण के केवल 7 मिनट की आवश्यकता है । पहले रिपोर्ट प्रोटोकॉल की तुलना में, इस नई विधि आसान है, जल्दी है और एसएसआर का पता लगाने के लिए कम रासायनिक एजेंट का उपयोग करता है । इसलिए, यह सरल, कम लागत, और प्रभावी चांदी दाग प्रोटोकॉल आनुवंशिक मानचित्रण और मार्कर एसएसआर मार्कर डेटा की एक त्वरित पीढ़ी द्वारा प्रजनन सहायता लाभ होगा ।
Introduction
पीसीआर के विकास आधारित मार्करों संयंत्र आनुवंशिकी और प्रजनन1के विज्ञान में क्रांति आई है । सरल अनुक्रम दोहराने (एसएसआर) मार्करों सबसे अधिक इस्तेमाल किया और सबसे बहुमुखी डीएनए मार्करों में से हैं । उनके व्यापक जीनोम कवरेज, बहुतायत, जीनोम विशिष्टता, और दोहराव heterozygous पादी2का पता लगाने के लिए उनके codominant विरासत के अलावा एसएसआर मार्करों के गुण में से कुछ हैं । कई अध्ययनों एसएसआर मार्करों का इस्तेमाल किया है आनुवंशिक विविधता की जांच, पैतृक ट्रैक, आनुवंशिक संपर्क नक्शे का निर्माण, और आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण लक्षण3,4के लिए नक्शे जीन ।
एसएसआर मार्करों के पीसीआर उत्पादों सामांयतः agarose या polyacrylamide जेल ट्रो का उपयोग कर अलग कर रहे है और फिर चांदी के साथ धुंधला या यूवी प्रकाश के तहत ethidium ब्रोमाइड के साथ धुंधला के बाद visualized । polyacrylamide जैल में डीएनए टुकड़े की चांदी धुंधला अंय धुंधला विधि5,6 से अधिक संवेदनशील है और व्यापक रूप से इस तरह के एसएसआर मार्करों7के रूप में डीएनए टुकड़े का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
कई जैविक प्रयोगशाला तकनीक की तरह, polyacrylamide जैल की चांदी धुंधला तेजी से अपनी पहली १९७९8में एक टुकड़ा दृश्य तकनीक के रूप में सूचित किया जा रहा है के बाद से सुधार हुआ है । तकनीक Bassam एट अल द्वारा डीएनए टुकड़े का पता लगाने के लिए शुरू में संशोधित किया गया था । 6 में १९९१ और फिर १९९४ में Sanguinetti और सहकर्मियों9 द्वारा सुधार । विधि आगे पिछले कुछ दशकों में अनुकूलित किया गया है6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. हालांकि, इन प्रोटोकॉल के अद्यतन संस्करण के अधिकांश अभी भी उच्च तकनीकी मांग और निर्धारण के लिए लंबी संसाधन समय और6बढ़ते, कि इन प्रोटोकॉल7के आवेदन की सीमा के रूप में कुछ कमियां है, 11. डीएनए टुकड़ा का पता लगाने की उच्च दक्षता के साथ कम लागत को जोड़ती है कि एक इष्टतम प्रोटोकॉल तत्काल जैविक अनुसंधान में चांदी के दाग के नियमित आवेदन के लिए आवश्यक है ।
इसके अलावा, polyacrylamide जेल denaturing और गैर denaturing polyacrylamide जैल में विभाजित किया जा सकता है, और दोनों चांदी धुंधला विधि का उपयोग एसएसआर मार्करों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रभाव और संकल्प है जो काफी अलग नहीं है, लेकिन गैर denaturing polyacrylamide जैल प्रक्रिया करने के लिए आसान कर रहे हैं और कम समय लेने के लिए16.
पिछले अनुसंधान के आधार पर15, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक गैर denaturing polyacrylamide जेल में एसएसआर मार्करों के त्वरित, आसान और कम लागत का पता लगाने के लिए विस्तार से एक अनुकूलित चांदी दाग प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
गर्भवती होने के बाद जेल की धुलाई एक महत्वपूर्ण कदम है । अपर्याप्त धोने समय और पानी की मात्रा थाली और जेल की सतह पर गर्भवती समाधान के अधूरा हटाने का कारण हो सकता है, और एक अंधेरे पृष्ठभूमि में परिणाम । उपय…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम गुआंग्डोंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (2015A030313500) द्वारा वित्त पोषित किया गया, प्रांतीय प्रमुख अंतरराष्ट्रीय सहकारी अनुसंधान मंच और गुआंग्डोंग उच्चतर शिक्षा (2015KGJHZ015) के प्रमुख वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना, विज्ञान और गुआंग्डोंग तंबाकू एकाधिकार प्रशासन की प्रौद्योगिकी योजना (२०१४०३, २०१७०५), गुआंग्डोंग चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (2016B020201001), स्नातक छात्रों के लिए राष्ट्रीय नवाचार प्रशिक्षण परियोजना (२०१७११०७८००१) । इस प्रकाशन में व्यापार नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख केवल विशिष्ट जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए है और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या बेचान का संकेत नहीं है । USDA एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है ।
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referências
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