Et hurtigt sølv farvning protokollen muliggør enkel og effektiv påvisning af SSR markører ved hjælp af en ikke-denatureringen polyacrylamid Gel
Summary
Her rapporterer vi en enkel og billig sølvfarvning protokol, som kræver kun tre reagenser og 7 min. behandling, og er velegnet til hurtig generation af høj kvalitet SSR data i den genetiske analyser.
Abstract
Simpel sekvens gentages (SSR) er en af de mest effektive markører, der anvendes i plante- og genetisk forskning og molekylær avlsprogram. Sølv farvning er en meget anvendt metode til påvisning af SSR markører i en polyacrylamid gel. Men konventionelle protokoller for sølv farvning er teknisk krævende og tidskrævende. Ligesom mange andre biologisk laboratorium har teknikker, sølv farvning protokoller været støt optimeret for at forbedre detektion effektivitet. Her rapporterer vi en forenklet sølvfarvning metode, der væsentligt reducerer reagens omkostninger og forbedrer påvisning opløsning og billede klarhed. Den nye metode kræver to hovedtrin (imprægnering og udvikling) og tre reagenser (sølvnitrat, natriumhydroxid og formaldehyd) og kun 7 min. behandling for en ikke-denatureringen polyacrylamid gel. I forhold til tidligere rapporteret protokoller, denne nye metode er lettere, hurtigere og bruger færre kemiske reagenser til SSR påvisning. Derfor, denne enkle, billige og effektive sølvfarvning protokollen vil gavne genetiske kortlægning og markør-assisteret avl af en hurtig generation af SSR markør data.
Introduction
Udviklingen af PCR-baseret markører har revolutioneret science for Plantegenetik og avl1. Simpel sekvens gentages (SSR) markører er blandt de mest almindeligt anvendte og mest alsidige DNA markører. Deres brede genom dækning, overflod, genom specificitet og repeterbarhed er nogle af fordelene ved SSR markører ud over deres codominant arv til påvisning af heterozygous genotyper2. Flere undersøgelser har brugt SSR markører til at undersøge genetiske mangfoldighed, spore herkomst, konstruere genetisk kobling maps og kortlægge gener for økonomisk vigtige træk3,4.
PCR produkter af SSR markører er almindeligvis adskilt ved hjælp af Agarosen eller polyacrylamid gel elektroforese og derefter visualiseres med sølv farvning eller under UV-lys efter farvning med ethidiumbromid. Sølv farvning af DNA fragmenter i polyacrylamidgeler er mere følsomme end de andre farvning metoder5,6 og har været meget anvendt til at påvise DNA fragmenter såsom SSR markører7.
Ligesom mange biologiske laboratoriemetoder, har sølv farvning af polyacrylamidgeler støt forbedret siden sin første blev rapporteret som et fragment visualisering teknik i 19798. Teknikken blev først ændret til påvisning af DNA-fragmenter af Bassam et al. 6 i 1991 og derefter forbedret af Sanguinetti og kolleger9 i 1994. Metoden har været yderligere optimeret i de sidste par årtier6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de fleste af disse opdaterede versioner af protokoller har dog stadig nogle ulemper såsom høje tekniske krav og lang behandlingstid for fiksering og montering6, at begrænse anvendelsen af disse protokoller7, 11. En optimal protokol, der kombinerer lave omkostninger med høj effektivitet af DNA fragment opdagelse er bydende nødvendigt for rutinemæssig anvendelse af sølvfarvning i biologiske forskning.
Derudover Polyacrylamiden kan opdeles i denaturering og ikke-denatureringen polyacrylamidgeler, og begge kan bruges til påvisning af SSR markører ved hjælp af sølvfarvning metode. Effekt og opløsning som afviger ikke væsentligt, men ikke-denatureringen polyacrylamidgeler er lettere at processen og tage mindre tid16.
På grundlag af den tidligere forskning15er formålet med den aktuelle undersøgelse at beskrive en optimeret sølvfarvning protokollen detaljeret til hurtig, nem og billig påvisning af SSR markører i et ikke-denatureringen polyacrylamid gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vask af gel efter imprægnering er et kritisk skridt. Utilstrækkelig vask tid og vand volumen kan forårsage ufuldstændig fjernelse af imprægnering løsning på overfladen af pladen og gelen, og resultere i en mørk baggrund. Den passende udvikling tid er et andet vigtigt skridt, over-udvikling kan resultere i en mørkebrun baggrund med lav kontrast billede af DNA-fragmenter. Derudover påvirker trinnet imprægnering væsentligt farvning effektivitet af DNA-fragmenter. Selv om udvide imprægnering tid over 5 min eller…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Guangdong Natural Science Foundation of China (2015A030313500), Provincial nøglen International kooperativ forskning Platform og den store videnskabelige forskning projekt af Guangdong videregående uddannelse (2015KGJHZ015), videnskab og Teknologi Plan af Guangdong tobak monopol Administration (201403, 201705), videnskab og teknologi Plan af Guangdong Kina (2016B020201001), den nationale Innovation uddannelsesprojekt for studerende (201711078001). Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende til brug for specifikke oplysninger og indebærer ikke anbefaling eller godkendelse af den US Department of Agriculture. USDA er en udbyder af lige muligheder og arbejdsgiver.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referências
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
