Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel
Summary
Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.
Abstract
Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) is één van de meest effectieve markers in plantaardige en dierlijke genetische onderzoek en moleculaire veredeling programma’s gebruikt. Zilveren kleuring is een veel gebruikte methode voor het detecteren van SSR merkers in een polyacrylamide-gel. Conventionele protocollen voor Zilveren kleuring zijn echter technisch veeleisende en tijdrovende. Net als veel andere biologische laboratorium zijn technieken, zilveren kleuring protocollen gestaag geoptimaliseerd om detectie efficiëntie te verbeteren. Wij rapporteren hier een vereenvoudigde silver kleuring methode die aanzienlijk vermindert reagens kosten en verbetert de opsporing resolutie en afbeelding duidelijkheid. De nieuwe methode vereist twee hoofdstappen (bevruchting en ontwikkeling) en drie reagentia (zilvernitraat, natriumhydroxide en formaldehyde) en slechts 7 min van verwerking voor een niet-denaturering polyacrylamide-gel. Vergeleken met de eerder gemelde protocollen, deze nieuwe methode is gemakkelijker, sneller en gebruikt minder chemische reagentia voor SSR detectie. Deze eenvoudige, goedkope en effectieve zilver kleuring protocol profiteert dus, genetische kartering en marker-assisted breeding door een snelle generatie van SSR marker gegevens.
Introduction
De ontwikkeling van PCR-gebaseerde markers heeft een revolutie teweeggebracht in de wetenschap van plantengenetica en fokken1. Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) markeringen behoren tot de meest gebruikte en meest veelzijdige DNA-merkers. Hun brede genoom dekking, overvloed, genoom specificiteit en herhaalbaarheid zijn enkele van de verdiensten van SSR markeringen naast hun codominant erfenis voor de detectie van heterozygoot genotypen2. Verschillende studies hebben SSR markeringen gebruikt om te onderzoeken van genetische diversiteit, bijhouden van afkomst, genetische koppeling kaarten bouwen, en genen voor economisch belangrijke traits3,4.
PCR producten van SSR markers worden vaak gescheiden met behulp van agarose of polyacrylamide-gel-elektroforese en vervolgens gevisualiseerd met zilveren kleuring of onder UV-licht na kleuring met ethidiumbromide. Zilveren kleuring van DNA fragmenten in polyacrylamide gels is gevoeliger dan het andere kleuring methoden5,6 en is wijd verbeid gebruikt om DNA-fragmenten zoals SSR markeringen7detecteren.
Zoals vele biologische laboratoriumtechnieken verbeterd zilveren kleuring van polyacrylamide gels gestaag is sinds haar eerste worden gerapporteerd als een fragment visualisatie techniek in 19798. De techniek werd in eerste instantie voor de opsporing van DNA-fragmenten gewijzigd door Bassam et al. 6 in 1991 en vervolgens verbeterd door Sanguinetti en collega’s9 in 1994. De methode heeft verder geoptimaliseerd in de laatste paar decennia6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. de meeste van deze bijgewerkte versies van de protocollen hebben echter nog steeds enkele nadelen zoals hoge technische vraag en lange verwerkingstijd voor fixatie en montage6, die de toepassing van deze protocollen7beperken, 11. Een optimale protocol dat goedkope met een hoog rendement van DNA fragment detectie combineert is dringend nodig voor routinematige toepassing van zilver kleuring in biologisch onderzoek.
Daarnaast polyacrylamidegel kan worden onderverdeeld in denatureren en niet-denaturering polyacrylamide gels en allebei kunnen worden gebruikt voor het detecteren van merkers van de SSR met behulp van de methode kleuring zilver. Het effect en de resolutie die niet aanzienlijk van elkaar verschillen, maar niet-denaturering polyacrylamide gels zijn gemakkelijker te proces en nemen minder tijd16.
Op basis van het vorige onderzoek15is het doel van de huidige studie om te beschrijven van een geoptimaliseerde zilver protocol in detail voor snelle, gemakkelijke en goedkope detecteren van SSR merkers in een niet-denaturering polyacrylamidegel kleuring.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het wassen van gel na bevruchting is een cruciale stap. Onvoldoende wassen tijd en water volume kan leiden tot de onvolledige verwijdering van bevruchting oplossing op het oppervlak van de plaat en de gel, en resulteren in een donkere achtergrond. De passende ontwikkeling tijd is een andere belangrijke stap, overmatige ontwikkeling kan resulteren in een donker-bruine achtergrond met laag contrast foto van DNA-fragmenten. Bovendien heeft de bevruchting stap aanzienlijk invloed op kleuring efficiëntie van DNA-fragmenten. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Guangdong Natural Science Foundation van China (2015A030313500), de provinciale sleutel International Cooperative onderzoeksplatform en de grote wetenschappelijke onderzoek Project van Guangdong hoger onderwijs (2015KGJHZ015), de wetenschap en Plan van de technologie van Guangdong tabak monopolie beheer (201403, 201705), de wetenschap en de technologie Plan van Guangdong van China (2016B020201001), het nationale innovatie opleidingsproject voor Voorgraadse studente (201711078001). Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend met het oog op het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of bekrachtiging door het Amerikaanse ministerie van landbouw. USDA is een aanbieder van gelijke kansen en de werkgever.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
Referências
- Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
- Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
- Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
- Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
- Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
- Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
- Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
- Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
- Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
- Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
- Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
- An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
- Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
- Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
- Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
- Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
- Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).
