Paraffin indlejring og tynde skæring af mikrobielle koloni biofilm til mikroskopisk analyse
Summary
Vi beskriver fiksering, paraffin indlejring og tynde skære teknikker for kimtal biofilm. I rede prøver, kan biofilm underkonstruktion og reporter udtryk mønstre visualiseres ved mikroskopi.
Abstract
Skæring via paraffin indlejring er en bredt etablerede teknik i eukaryote systemer. Her giver vi en metode til fiksering, indlejring, og skæring af intakt mikrobielle koloni biofilm ved hjælp af perfunderet paraffinvoks. For at tilpasse denne metode til brug på koloni biofilm, vi udviklet teknikker til vedligeholdelse af hver prøve på substratet vækst og laminering det med en agar overlayer, og tilføjet lysin til Fikseringsvæske løsningen. Disse optimeringer forbedre prøve opbevaring og bevarelse af micromorphological funktioner. Prøver forberedt på denne måde er indstillet til tynde skæring og imaging af lys, fluorescens og transmissions Elektron Mikroskopi. Vi har anvendt denne teknik til kolonien biofilm af Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisog Vibrio cholerae. Det høje niveau af detailrigdommen i prøver genereret ved denne metode, kombineret med reporter stamme engineering eller brug af specifikke farvestoffer, kan give spændende indsigt i fysiologi og udvikling af mikrobielle samfund.
Introduction
De fleste mikrober har kapacitet til form biofilm, holdt Fællesskaber af celler sammen af egen-producerede matricer. Biofilm kan dyrkes i mange typer af fysiske opsætninger, med forskellige regimer af næringsstof og substrat bestemmelse. Specifikke assays til Biofilmdannelse tendens til at give reproducerbare flercellede strukturer, og udbredte arkitekturer er observeret for Fylogenetisk forskelligartede arter på fællesskabsplan eller makroskopisk plan. Når mikrober er vokset som kolonier på solid medium under en atmosfære, makroskopisk morfologi formidler oplysninger om kapacitet til produktion af matrix og ofte korrelerer med andre træk 1,2,3. Den interne arkitektur af mikrobielle kolonier kan også give et fingerpeg om biofilm-specifikke kemi og fysiologi, men har været svært at karakterisere. Seneste programmer af cryoembedding og cryosectioning teknikker til bakteriel kolonier har aktiveret imaging og visualisering af specifikke funktioner i hidtil uset opløsning 4,5,6. Undersøgelser med animalsk væv har dog vist at paraffin indlejring giver overlegen bevarelse af morfologi i forhold til cryoembedding 7 og har været brugt til at visualisere bakterier i væv 8,9. Vi har derfor udviklet en protokol for fiksering, paraffin indlejring og tynde skæring af mikrobielle koloni biofilm. Her vil vi beskrive forberedelse af Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biofilm tyndslib 10,11, men vi har også med succes anvendt denne teknik til biofilm dannes af bakterier Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, og Vibrio cholerae12.
Processen med integrering af paraffin og tynd-skæring biofilm følger en simpel logik. Først, biofilm er indkapslet i et lag af agar at bevare morfologi under behandlingen. For det andet indkapslet biofilm er neddykket i fiksativ til bitmapgenkendelse makromolekyler og bevare micromorphology. Disse er derefter dehydreret med alkohol, ryddet med en mere ikke-polære opløsningsmidler og derefter infiltreret med flydende paraffin voks. Når infiltreret, er prøverne indlejret i voks blokke for skæring. Sektioner er skåret, monteret på dias og derefter rehydreret for at returnere dem til en mere naturlig tilstand. Fra dette punkt, kan de farves eller omfattet af montering medium til mikroskopisk analyse.
Denne protokol producerer tynde sektioner af mikrobielle biofilm egnet til histologisk analyse. Koloni biofilm delstrukturer er synlige, når tyndslib udarbejdet ved hjælp af denne metode er afbildet ved lysmikroskopi. Biofilm kan også dyrkes på medier indeholdende fluorescerende pletter specifikke for individuelle funktioner eller plettet på trinnet rehydrering umiddelbart inden montering (trin 9,5-9,6). Endelig, mikrober kan blive manipuleret til at producere fluorescerende proteiner i en konstitutiv eller regulerede mode tillader i situ rapportering af celle distribution eller gen udtryk inden for disse samfund. Vi har brugt disse metoder til at bestemme koloni biofilm dybde, celle distribution, matrix distribution, vækstmønstre og spatiotemporelle genekspression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Integrering af paraffin og tynd-skæring vævsprøver er en klassisk histologisk teknik, der gør det muligt for billeddannelse af mikro-morfologiske strukturer og er almindeligt anvendt på eukaryote væv, og er blevet anvendt med en vis succes på mikrobiel prøver8 ,9. Mens cryoembedding giver mulighed for stærk fastholdelse af endogene og immunfluorescent signal, er paraffin indlejring generelt at foretrække, da det giver bedre bevarelse af morfologi<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NSF karriere AWARD 1553023 og NIH/NIAID award R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
Referências
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?. Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
