パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面
Summary
固定、パラフィン包埋、および微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面技法について述べる。作製した試料では、顕微鏡によるバイオ フィルムの基礎部分やレポーターの発現パターンを視覚化できます。
Abstract
真核生物において広く確立された技術は、パラフィン包埋による区分します。ここでの埋め込み・灌流のパラフィン ワックスを使用してそのまま微生物コロニー バイオ フィルムの断面、固定法を実施します。コロニー バイオ フィルムで使用するためこのメソッドを適応し、我々 はその成長基板の各サンプルを維持すると、寒天オーバーレイヤーのラミネート技術を開発し、固定液にリジンを追加しました。これらの最適化は、微細形態機能のサンプルの保存/保護を向上させます。この方法で作製した試料は、薄膜の断面と光、蛍光、および透過電子顕微鏡によるイメージングに適しています。緑膿菌 synxantha 菌、枯草菌、コレラ菌のコロニー バイオ フィルムにこの手法を用いています。ディテールはこのメソッドによって生成されるサンプルでの高レベル レポーターひずみと組み合わせて工学または特定の染料の使用は生理学と微生物の開発にエキサイティングな洞察力を提供することができます。
Introduction
ほとんど微生物バイオ フィルム フォームする能力があります、セルのコミュニティは、セルフ プロデュースの行列で一緒に開催。バイオ フィルムは、栄養素と基板の提供の様々 な体制で物理的なセットアップの多くの種類で栽培できます。再現可能な多細胞構造を生成する傾向がある特定のアッセイのバイオ フィルム形成とコミュニティまたは巨視的レベルで系統発生的に多様な種のための一般的なアーキテクチャが観察されます。微生物は雰囲気下で固体媒体の植民地で栽培される、肉眼形態はマトリックス生産能力についての情報を伝えるし、他の特徴1,2,3とよく相関します。微生物コロニーの内部アーキテクチャは、バイオ フィルムに固有の化学および生理学に関する手がかりを提供することもが特徴付けることは困難されています。細菌のコロニーに cryoembedding、セクショニングの技術の最近のアプリケーションは、画像と前例のない解像度4,5,6で特定の機能の可視化に有効にしています。しかし、動物組織を用いた研究は、パラフィン包埋 cryoembedding 7と比較されたとき形態の優れた保存を提供し、組織8,9の細菌を視覚化するために使用されていることを示しています。したがって、固定、パラフィン包埋、微生物コロニー バイオ フィルムの薄切片法にプロトコルを開発しました。ここでは、緑膿菌PA14 コロニー バイオ フィルム中薄いセクション10,11, の作製について述べるが、の細菌によって形成されるバイオ フィルムにこの手法を行ったも正常にSynxantha 緑膿菌、枯草菌、とコレラ12。
パラフィン包埋、薄切片のバイオ フィルムの簡単な論理は次のとおりです。まず、バイオ フィルムは処理の間に形態を維持する寒天の層に包まれています。第二に、包まれてバイオ架橋高分子に定着剤に沈んでいるし、形態を維持します。アルコールで脱水しより非極性溶媒でクリアし、し、液体のパラフィン ワックスを浸透させた。潜入、一度サンプルは区分のためのワックスのブロックに埋め込まれています。セクションは、カット、スライド、マウントより本来の状態に戻すために復元します。この時点から、染色したり顕微鏡分析のためのメディアをマウントで覆われています。
このプロトコルには、組織学的解析に適した微生物バイオ フィルムの薄い部分が生成されます。コロニー バイオ フィルムの部分は、このメソッドを使用して薄い切片を光学顕微鏡検査によってイメージが表示されます。バイオ フィルムの個々 の機能のために特定のメディア含む蛍光汚れに成長してまたは退避手順の (ステップ 9.5 9.6) をマウントする前にすぐに染色もできます。最後に、その場でこれらのコミュニティ内での細胞分布や遺伝子発現の報告を許可する構成または規制的に蛍光蛋白質を生成する微生物を設計することができます。コロニー バイオ フィルム深度、セル分布、マトリックス分布、成長パターン、時空間の遺伝子発現を決定するこれらのメソッドを使いました。
Protocol
Representative Results
Discussion
パラフィン包埋、薄切片組織サンプルは微細形態構造のイメージングを有効にし、一般に真核生物の組織、使用、微生物サンプル8 にいくつかの成功と適用されている古典的な組織学的手法 ,9。Cryoembedding 内因性および蛍光信号の強力な保持できますが、パラフィン包埋は一般に望ましい形態16のより良い保全を提供します。この?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NSF のキャリア賞を受賞 1553023 と NIH/NIAID 賞 R01AI103369 によって支持されました。
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
Referências
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