Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico
Summary
Describimos a fijación, inclusión en parafina y finas técnicas seccionamiento de biofilms microbianos de la Colonia. En muestras preparadas, patrones de expresión de subestructura y reportero de biofilm pueden visualizarse por microscopía.
Abstract
Seccionamiento mediante inclusión en parafina es una técnica ampliamente establecida en sistemas eucarióticos. Aquí proporcionamos un método para la fijación, inclusión y secciones de biofilms intacto Colonia microbiana utilizando parafina perfundido. Para adaptar este método para el uso en Colonia biofilms, desarrollado técnicas para mantener cada muestra en su sustrato de crecimiento y laminar con un overlayer de agar y lisina ha añadido a la solución fijadora. Estas optimizaciones mejoran la retención de la muestra y la preservación de Características micromorfológicas. Muestras preparadas de esta manera son susceptibles de fino corte y proyección de imagen por microscopía de luz, fluorescencia y transmisión. Hemos aplicado esta técnica a biopelículas de la colonia de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisy Vibrio cholerae. El alto nivel de detalle visible en las muestras generadas por este método, combinado con cepa reportero ingeniería o el uso de colorantes específicos, puede proporcionar ideas interesantes sobre la fisiología y el desarrollo de las comunidades microbianas.
Introduction
La mayoría de microbios tienen la capacidad para forma biofilms, comunidades de células ligan por matrices de producción propia. Biofilms se puede cultivar en muchos tipos de configuraciones físicas, con diversos regímenes de suministro de nutrientes y sustrato. Ensayos específicos para la formación del biofilm tienden a producir estructuras multicelulares reproducibles, y arquitecturas comunes se observan especies filogenéticamente diversas a nivel macroscópico o comunidad. Cuando microbios crecen como colonias en medio sólido bajo una atmósfera, morfología macroscópica transmite información sobre la capacidad de producción de la matriz y a menudo se correlaciona con otros rasgos 1,2,3. La arquitectura interna de las colonias microbianas también puede proporcionar pistas sobre biofilm específica química y fisiología, pero ha sido difícil de caracterizar. Recientes aplicaciones de las técnicas de crioinclusiones y cryosectioning a colonias bacterianas han permitido la proyección de imagen y visualización de características específicas en la resolución sin precedentes 4,5,6. Sin embargo, estudios con tejidos animales han demostrado que inclusión en parafina proporciona superior conservación de la morfología comparada con crioinclusiones 7 y se ha utilizado para visualizar las bacterias en los tejidos 8,9. Por lo tanto hemos desarrollado un protocolo para la fijación, inclusión en parafina y finas secciones de biofilms microbianos de la Colonia. Aquí, describimos la preparación de secciones delgadas 10,11de Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm, pero también con éxito hemos aplicado esta técnica a biofilms formados por las bacterias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, y Vibrio cholerae12.
El proceso de inclusión en parafina y secciones delgadas de biopelículas sigue una simple lógica. En primer lugar, los biofilms están contenidos en una capa de agar para preservar la morfología durante el proceso. En segundo lugar, los biofilms encajonadas son sumergidos en un fijador para macromoléculas de la reticulación y preservar micromorfología. Estos son luego deshidratados con alcohol, limpiados con un solvente más polar y luego infiltrados con cera de parafina líquida. Una vez infiltrado, las muestras están incrustadas en bloques de cera para seccionamiento. Las secciones son corte montadas en portaobjetos y luego rehidratadas para volver a un estado más nativo. Desde este punto, pueden ser manchadas o cubiertas de medio de montaje para el análisis microscópico.
Este protocolo produce finas secciones de biofilms microbianos adecuados para análisis histológico. Subestructuras de biofilm de Colonia son accesibles cuando secciones delgadas preparadas utilizando este método son imágenes por microscopia ligera. Biofilms también puede ser crecidos en las manchas fluorescentes que contienen los medios de comunicación específicos para características individuales o manchados en la etapa de rehidratación, inmediatamente antes del montaje (pasos 9.5 9.6). Por último, microbios pueden ser diseñados para producir proteínas fluorescentes de manera constitutiva o regulada, lo que en situ informes de expresión de la distribución o gen de la célula dentro de estas comunidades. Hemos utilizado estos métodos para determinar la profundidad de biofilm de Colonia, distribución celular, distribución de la matriz, patrones de crecimiento y expresión génica espaciotemporal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muestras de inclusión en parafina y secciones delgadas del tejido es una técnica histológica clásica que permite proyección de imagen de estructuras morfológicas micro se usa comúnmente en los tejidos eucarióticos y se ha aplicado con cierto éxito a muestras microbianas8 ,9. Mientras que crioinclusiones permite la fuerte retención de señal endógena e inmunofluorescente, inclusión en parafina es generalmente preferible ya que proporciona mejor preser…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NSF carrera Premio 1553023 y Premio de NIH/NIAID R01AI103369.
Materials
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
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