שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים
Summary
בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.
Abstract
חולים עם תסמונת סיוגרן, מחלה אוטואימונית משפיע על בלוטות אקסוקרינית, לפתח דלקת בלוטת הרוק, הפחיתו ייצור רוק. באופן דומה, ייצור רוק נפגעו קשות בחולים שקיבלו טיפול קרינה עבור סרטן הראש והצוואר. מודלים מכרסמים, שפותחה כדי לחקות תנאים קליניים אלה, להקל על הבנת הפתוגנזה המחלה ולאפשר הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, היכולת למדוד באופן מדויק, reproducibly ו שוב ושוב תפקוד בלוטת הרוק במודלים של בעלי חיים הוא קריטי. בונים על הליכים שתואר קודם לכן בספרות, שיטה פותחה עונה על קריטריונים אלה, שימש להערכת תפקוד בלוטת הרוק בעכברים. יתרון נוסף של שיטה חדשה היא כי זה הוא שולט בקלות, יש גרסא חדשה בין המפעיל. תפקוד בלוטת הרוק מוערך את הסכום (משקל או נפח) או קצב (mL/min) של הרוק מיוצר בתגובה לגירוי פילוקרפין. הרוק שנאספו הוא מקור טוב עבור הניתוחים של תכולת החלבון, ריכוזים בנוגדנים מולקולות אחרות.
Introduction
בלוטות הרוק לייצר רוק בתגובה למגוון גירויים נוירולוגית ועל מכניים1. הגירויים מתבצעות דרך מערכת העצבים הסימפתטית, הפארא-סימפתטי לקולטנים adrenergic, שימוש ב בלוטת. פילוקרפין הוא סוכן שימוש, פארא-sympathomimetic, אשר פועלת בעיקר על קולטנים מוסקריניים. בבלוטת הרוק, זה גורם הייצור של רוק על ידי משחק על קולטן מוסקריני M31. ייצור רוק בעקבות פילוקרפין המינהל הוא מחוון ליכולת של בלוטות הרוק להגיב לגירוי, הוא נפוץ כאמצעי של תפקוד בלוטת הרוק.
מדידה מדויקת של ייצור רוק הוא קריטי במחקר של מחלות בלוטת הרוק כולל תסמונת סיוגרן2 ופציעה קרינה בעקבות הראש והצוואר סרטן טיפול3. פותחו מספר שיטות שונות למדידת ייצור רוק בחולדות. אלה כוללות תעלות ישירה של צינור הרוק excretory4, אוסף של רוק בין חלל הפה תחת ואקום5, וכן אוסף באמצעות נימי זכוכית6 או7,micropipette8, 9. ישיר תעלות התעלה הרוק מספק ביותר רוק טהור ומדויקים. עם זאת, זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית, פוטנציאל גרימת חבלה ductal מונע אוספים רוק חוזרות של אותה חיה. איסוף הרוק תחת ואקום יכול להוביל לתוצאות משתנה עקב ייבוש של רוק מהצינור. אובדן זה היא מוגזמת נוספת אצל עכברים עם ריור מופחת. נימים זכוכית לאפשר את האוסף של רוק עבור ניתוחים שלאחר מכן, אולם, שינויי צמיגות של רוק מופרש במדינה נגועים מונע מילוי יעיל נים. יתרה מזאת, הניסיונות לטאטא את חלל הפה כדי לאסוף שאריות הרוק יכול להוביל לפציעה. שיטת pipet מאפשר איסוף מלאה, המפעיל אותו, זה עקביות במידה ניכרת בין ניסויים. עם זאת, מסיבות לא ידועות, שיטה זו מציגה וריאציה משמעותי בין מפעילי שונים. לכן, כדי לאפשר השוואות המתאים, הוא הופך להיות הכרחי שבו המפעיל אותו מבצע את כל הניסויים הקשורים לפרוייקט ספציפי. ברור, זה מייצג חיסרון מרכזי עבור מעבדה.
כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פותחה כי משלב רוק אוסף שיטות להשתמש עבור בני אדם ומכרסמים. שיטת ספוגית, המתוארים להלן למדידת נפח פילוקרפין-induced רוק פשוטה, לשחזור, לא השפיעו על ידי המפעיל, ניתן לבצע שוב ושוב על אותה חיה. בנוסף, היא מאפשרת איסוף הרוק עבור ניתוחים עוקבות של חלבונים, immunoglobulins או מולקולות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצור רוק הוא תהליך מורכב, מושפע מגורמים רבים. לכן, מדידת תפקוד בלוטת הרוק בחיות מעבדה עשויה להיות אתגר. אתגר נוסף הוא כי מדידות חוזרות של תפקוד בלוטת הרוק אצל אותה חיה נדרשים להקים תחילתה של מחלה או להפגין התאוששות לאחר הטיפול.
השיטה ספוגית שתוארו בדו ח זה פשוטה מבחינה טכנית…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים, הלאומית המכון של שיניים ומחקר ואסטתיים (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referências
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
