En metod för mätning av Saliv-körtel funktion hos möss
Summary
Spottkörtel svikt är en frekvent följd av autoimmun sjukdom och strålbehandling. Reproducerbara utvärdering av Saliv-körtel funktion i musmodeller av dessa sjukdomar är en teknisk utmaning. Här beskrivs en enkel metod för exakt och reproducerbar mätning av salivproduktion hos möss.
Abstract
Patienter med Sjögrens syndrom, en autoimmun sjukdom som påverkar de exokrina körtlarna, utveckla Saliv-körtel inflammation och har nedsatt salivproduktion. På samma sätt äventyras allvarligt salivproduktion hos patienter som får strålbehandling för huvud och hals cancer. Gnagare modeller, som utvecklats för att efterlikna dessa kliniska tillstånd, underlätta förståelsen av sjukdomen patogenesen och möjliggör utvecklingen av nya terapeutiska strategier. Därför är förmågan att korrekt reproducibly och upprepade gånger mäta Saliv-körtel funktion i djurmodeller kritisk. Bygger på förfaranden som tidigare beskrivits i litteraturen, utvecklades en metod som uppfyller dessa kriterier och användes för att utvärdera Saliv-körtel funktion hos möss. En ytterligare fördel med denna nya metod är att det är enkelt behärskar, och har lite mellan operatören variant. Saliv-körtel funktion bedöms som mängden (vikt eller volym) eller hastighet (mL/min) av saliv som produceras som svar på pilokarpin stimulering. Den samlade saliven är en bra källa för analyser av proteinhalt, immunglobulin koncentrationer och andra biomolekyler.
Introduction
Spottkörtlarna producerar saliv som svar på en mängd olika neurologiska och mekaniska stimuli1. Stimuli bärs genom det sympatiska och parasympatiska nervsystemet till adrenerga och kolinerga receptorer i körteln. Pilokarpin är en kolinerga, para-sympatomimetiska medel som verkar huvudsakligen på muskarina receptorer. I den saliv-körteln inducerar det produktion av saliv genom att agera på muskarina acetylkolin receptorns M31. Salivproduktion administrering pilokarpin är en indikator på spottkörtlarna förmåga att reagera på stimulans och används ofta som ett mått på Saliv-körtel funktion.
Noggrann mätning av salivproduktion är kritisk i studien av spottkörteln sjukdomar inklusive Sjögrens syndrom2 och strålning skada efter huvud och hals cancer behandling3. Flera olika metoder har utvecklats för att mäta salivproduktion hos gnagare. Dessa inkluderar direkta kanylering av utsöndringar saliv kanal4, insamling av saliv från munhålan under vakuum5och samling med glas kapillärer6 eller en mikropipett7,8, 9. direkta kanylering av saliv kanalen ger de mest exakta och rena saliv. Men detta är ett tekniskt krävande ingrepp och potentialen för duktal skadar utesluter repetitiva saliv samlingar från samma djur. Att samla saliv under vakuum kan leda till varierande resultat på grund av torkning av saliv från röret. Denna förlust är ytterligare överdriven hos möss med minskad salivavsöndring. Glas kapillärer tillåta insamling av saliv för efterföljande analyser, men förändringar i viskositet i saliv utsöndras i sjuka tillstånd förhindrar effektiv fyllning av kapillären. Vidare kan försök att sopa munhålan för att samla in resterande saliv leda till skada. Pipettera metoden möjliggör komplett samling, och för samma operatör, är det anmärkningsvärt konsekvent mellan experiment. Men av okänd anledning visar denna metod betydande variation mellan olika operatörer. Därför, för att möjliggöra lämpliga jämförelser, blir det nödvändigt att samma operatör utför alla de experiment som relaterade till ett visst projekt. Tydligt, utgör detta en stor nackdel för ett laboratorium.
För att övervinna dessa problem, utvecklades ett förfarande att kombinerar metoder för insamling av saliv används för människa och gnagare. Metoden kompress, som beskrivs nedan för att mäta pilokarpin-inducerad saliv volym är enkel, reproducerbara, inte påverkas av operatören, och kan utföras flera gånger på samma djur. Det kan dessutom samla saliv för efterföljande analys av proteiner, immunglobuliner eller andra biomolekyler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Salivproduktion är en komplex process och påverkas av många faktorer. Därför kan mäta Saliv-körtel funktion hos försöksdjur vara en utmaning. Ytterligare en utmaning är att upprepade mätningar av Saliv-körtel funktion på samma djur är skyldiga att upprätta sjukdomsutbrott eller demonstrera återhämtning efter behandling.
Den provstickan metod som beskrivs i denna rapport är tekniskt enkel att utföra med flera alternativ för att representera data. Resultaten är reproducerbar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien har finansierats genom ett bidrag från National Institutes of Health, nationella institutet för tandvård och kraniofaciala forskning (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referências
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
