A identificação precisa de células satélites é essencial para estudar as suas funções sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Este artigo apresenta um protocolo para identificar células satélites em seções de músculo esquelético adulto baseado em imunofluorescência manchando.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imunofluorescência é um método eficaz que ajuda a identificar diferentes tipos de células em secções de tecido. A fim de estudar a população celular desejado, anticorpos para marcadores de célula específica são aplicados em cortes de tecido. No músculo esquelético adulto, células satélites (SCs) são as células-tronco que contribuem para a regeneração e reparação muscular. Portanto, é importante Visualizar e traçar a população de células satélite sob diferentes condições fisiológicas. No músculo esquelético a descansar, SCs residam entre a lâmina basal e a membrana plasmática de miofibras. Um marcador comumente usado para a identificação de SCs no myofibers ou em cultura de células é a proteína emparelhados caixa Pax7. Neste artigo, um protocolo de imunofluorescência Pax7 otimizado em seções de músculo esquelético é apresentado que minimiza a mancha não específica e plano de fundo. Outro anticorpo que reconhece uma proteína (laminina) da lâmina basal também foi adicionado para ajudar a identificar os protocolos de SCs. Similar também pode ser usado para executar a rotulagem duplos ou triplos, com Pax7 e anticorpos para proteínas adicionais de interesse.
Introdução
Músculo esquelético é composto de células musculares multinucleadas, chamado myotubes, organizado em myofibers, que geram força e movimentos através de contração. Mais os músculos esqueléticos, com exceção de alguns músculos craniofaciais, são derivados de uma estrutura temporária embrionária chamada um somite1. Células precursoras miogênico delaminate partir do somite epitelial tornar mioblastos. Mioblastos mais diferenciarem em miócitos que fundem-se para tornar-se myotubes para formar myofibers multi nucleada. O processo acima é chamado myogenesis e é caracterizado pelo controle temporalmente-regulado da expressão do gene. Miogênico precurso....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Neste protocolo, os músculos anterior membro posterior de ratos adultos (2-6 meses), tibial anterior (TA) e extensor longo dos dedos (EDI), foram utilizados como exemplo para realizar a imunofluorescência coloração sobre seus SCs. Todas as etapas de manipulação de camundongos e músculo dissecções de tecidos foram aprovadas pelo Comitê de uso (ACUC) de NIAMS/NIH e cuidado Animal.
1. dissecar o músculo TA/EDI desde o membro posterior Mouse
- Eutanásia o mouse numa câmara cheia de eutanásia CO2 sob as diretrizes do ACUC de NIH. Se necessário, realize deslocamento cervical.
- Coloque o rato voltado para cima sobre uma....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Seguindo os passos acima, SCs podem ser visualizadas com êxito em seções de músculo adulto descanso sob um microscópio fluorescente (Figura 1). Embora o tecido muscular adulto tem forte autofluorescência de determinado tipo de fibras, as tinturas de série brilhantes Alexa podem superar o ruído de fundo e destaca-se o sinal (figura 1A, B; cabeças de seta). A microscopia confocal dois fotões capta uma imagem relati.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo acima foi baseado em um método de coloração de Pax7/MF20 no zebrafish músculo esquelético12. As soluções utilizadas e bloqueando os passos são idênticos ou semelhantes. Os anticorpos utilizados são idênticos. As etapas ajustadas basearam-se nas características do tecido muscular de rato e SCs. Primeiro, laminina anticorpo foi adicionado na mistura para ajudar a visualizar e confirmar a posição do SCs. Foi particularmente útil para contar o número de SCs sob o microscópio, quando usando.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a seção de Imaging luz NIAMS para fornecer os microscópios e a ajuda técnica. Os anticorpos MF20 e Pax7 foram obtidos de estudos do desenvolvimento do Hybridoma banco desenvolvido sob os auspícios dos FORMULADORES e mantido pela departamento de ciências biológicas, da Universidade de Iowa, Iowa City. Este trabalho foi financiado pelo programa Intramural de pesquisa, NIAMS, do institutos nacionais da saúde.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Temperatura Ótima de Corte (O.C.T.) composto | Microscopia Eletrônica Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED | PELLA 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Soro de Cabra Normal | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Tampão Citrato | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 anticorpo monoclonal de camundongo (IgG1) (sobrenadante) | Estudo de Desenvolvimento Banco de Hibridoma N | /A | |
| Anticorpo policlonal de coelho de laminina | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 anticorpo monoclonal de camundongo (IgG2b) (sobrenadante) | Estudo de Desenvolvimento Hibridoma Bank | N/A | |
| Anticorpo secundário de absorção cruzada IgG1 anti-camundongo de cabra, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Anticorpo secundário de absorção cruzada IgG2<>b de cabra, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho de cabra IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 | |||
| fluorescente de campo amplo Leica DM6000 | |||
| fluorescente de campo amplo Leica DMR | |||
| Microscópio confocal Zeiss LSM510 Microscópio | |||
| confocal Zeiss LSM780 | |||
| Panela | de pressão eletrônica Cuisinart |
Referências
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell D....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
