Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar
Summary
Exakt identifiering av satellit celler är viktigt för att studera deras funktioner under olika fysiologiska och patologiska förhållanden. Denna artikel presenterar ett protokoll för att identifiera satellit celler på vuxen skelettmuskulatur sektioner av immunofluorescens-baserade färgning.
Abstract
Immunofluorescens är en effektiv metod som hjälper till att identifiera olika celltyper på vävnadssnitt. För att studera önskad cell befolkningen, appliceras antikroppar för viss cell markörer på vävnadssnitt. I vuxen skelettmuskulatur är satellit celler (SCs) stamceller som bidrar till muskel reparation och förnyelse. Det är därför viktigt att visualisera och spåra satellit cell befolkningen under olika fysiologiska förhållanden. Vilande skelettmuskulatur, bosatta SCs mellan basala lamina och myofiber plasmamembranet. En vanligt förekommande markör för att identifiera SCs på myofibers eller i cellkultur är parade box proteinet Pax7. I den här artikeln presenteras en optimerad Pax7 immunofluorescens protokoll på skelettmuskulaturen sektioner som minimerar icke-specifik färgning och bakgrund. En annan antikropp som känner igen ett protein (laminin) av den basala lamina lades för att identifiera SCs. liknande protokoll kan även användas att utföra dubbel eller trippel märkning med Pax7 och antikroppar för ytterligare proteiner av intresse.
Introduction
Skelettmuskulaturen är sammansatt av Multinucleära muskelceller, kallas myotubes, organiserade i myofibers, som genererar kraft och rörelser genom kontraktion. Mest skelettmuskulaturen, utom vissa kraniofaciala muskler, härrör från en tillfällig embryonal struktur som kallas en somite1. Myogenic prekursorceller delaminate från de epiteliala somite att bli myoblasts. Myoblasts ytterligare differentieras till myocyter som säkring till bli myotubes att bilda flera kärnförsedda myofibers. Ovanstående process kallas myogenesis och kännetecknas av temporally-reglerade kontroll av genuttryck. Myogenic prekursorer uttrycka Pax3 och Pax7, medan myoblasts express MyoD och/eller Myf5 och myocyter express myogenin och myosins2,3. Muskeltillväxt är en process där myofibers bli större genom att införliva mer myonuclei i befintliga fibrer (hyperplasi) och genom en ökning av muskel fiber storlek (hypertrofi)4. Under muskeltillväxt finns det en hållbar källa till myogenic celler som har stamceller egenskaper att de kan differentiera och själv förnya. Dessa celler kallas satellit celler baserat på deras fysiska plats mellan sarcolemma (cellmembranet av myofiber) och basala lamina5. SCs kraftigt bidra till muskeltillväxt i den juvenila fasen (de första 2-3 veckorna av postnatal möss), men blivit quiescent i vila vuxen muskel6. Anmärkningsvärt, kan de återaktiveras svar till muskel skadar och differentieras till nya muskelceller att reparera den skadada muskeln7.
Stem Cellegenskaper gör studien av SCs relevanta för både grundläggande muskel biologi och behandlingar av muskel sjukdomar8. Som ett resultat, har det varit ett område med intensiv undersökning under de senaste decennierna. En enorma framsteg har gjorts i dissekera den genetik och epigenetik av SCs9,10. Tekniker som används i isolera och identifiera SCs i situ var utvecklad och optimerad längs väg11. Immunofluorescerande färgning möjliggör identifiering av SCs med hjälp av specifika antikroppar, inklusive som för Pax7. Dock återge liten och liten storlek av SCs kombinerat med en stark auto-fluorescens vuxen skelettmuskulaturen vävnad visualiseringen utmanande. Här beskriver vi ett Immunofluorescerande färgning protokoll optimerad för mus muskelvävnad för Pax7 och baserat på en befintlig metod för zebrafiskar muskel12. Dessutom är en Laminin antikropp märkt med en distinkt fluorophore anställd för att identifiera den basala lamina som SCs är belägna. Detta protokoll kan konsekvent visualisering av Pax7-positiv SCs och myogenic prekursorer under alla testade fysiologiska förhållanden och utvecklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det ovannämnda protokollet baserades på en metod för Pax7/MF20 färgning på zebrafiskar skelettmuskulaturen12. Lösningarna används och blockera steg är identiska eller liknande. De antikroppar som används är identiska. Justerade stegen bygger på funktionerna i mus muskelvävnad och SCs. Först lades Laminin antikropp i mixen för att visualisera och bekräfta placeringen av SCs. Det var särskilt bra att räkna antalet SCs under lupp när du använder dubbla filter kuben av 488/555; Dett…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar NIAMS Light Imaging avsnittet för att tillhandahålla Mikroskop och teknisk hjälp. MF20 och Pax7 antikropparna erhölls från utvecklande studier Hybridomteknik banken utvecklades under överinseende av NICHD och underhålls av den institutionen för biologiska vetenskaper, The University of Iowa, Iowa City. Detta arbete stöds av den intramurala forskning Program av NIAMS av National Institutes of Health.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referências
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
