Pax7 और Laminin एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कंकाल मांसपेशी उपग्रह कोशिकाओं की पहचान
Summary
सैटेलाइट कोशिकाओं की सटीक पहचान विभिन्न शारीरिक और रोग की स्थिति के तहत उनके कार्यों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है । इस लेख इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित धुंधला द्वारा वयस्क कंकाल की मांसपेशी वर्गों पर उपग्रह कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ।
Abstract
इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक प्रभावी तरीका है कि ऊतक वर्गों पर विभिन्न कोशिका प्रकार की पहचान करने में मदद करता है. आदेश में वांछित सेल जनसंख्या का अध्ययन करने के लिए, विशिष्ट सेल मार्कर के लिए एंटीबॉडी ऊतक वर्गों पर लागू कर रहे हैं. वयस्क कंकाल की मांसपेशी में, उपग्रह कोशिकाओं (SCs) स्टेम कोशिकाओं है कि मांसपेशियों की मरंमत और पुनर्जनन में योगदान कर रहे हैं । इसलिए, यह कल्पना और विभिंन शारीरिक स्थितियों के तहत उपग्रह कोशिका जनसंख्या का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है । कंकाल की मांसपेशी आराम में, SCs बेसल लेमिना और myofiber प्लाज्मा झिल्ली के बीच रहते हैं । myofibers पर या कोशिका संस्कृति में SCs की पहचान के लिए एक आम तौर पर इस्तेमाल मार्कर युग्मित बॉक्स प्रोटीन Pax7 है । इस अनुच्छेद में, कंकाल की मांसपेशी वर्गों पर एक अनुकूलित Pax7 इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है कि गैर विशिष्ट धुंधला और पृष्ठभूमि को कम करता है । बेसल लेमिना के एक प्रोटीन (laminin) को पहचानता एक अन्य एंटीबॉडी भी SCs की पहचान करने में मदद करने के लिए जोड़ा गया था । इसी तरह के प्रोटोकॉल भी ब्याज के अतिरिक्त प्रोटीन के लिए Pax7 और एंटीबॉडी के साथ डबल या ट्रिपल लेबल प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी multinucleated मांसपेशी कोशिकाओं से बना है, myotubes बुलाया, myofibers, जो संकुचन के माध्यम से बल और आंदोलनों उत्पन्न में आयोजित किया । सबसे कंकाल की मांसपेशियों, कुछ craniofacial मांसपेशियों को छोड़कर, एक अस्थाई भ्रूण संरचना से प्राप्त कर रहे है एक somite1कहा जाता है । Myogenic अग्रदूत कोशिकाओं उपकला somite से myoblasts बनने के लिए फाड़ना । Myoblasts आगे myocytes में अंतर है कि फ्यूज बहु nucleated myofibers बनाने के लिए myotubes बनने के लिए । इसके बाद के संस्करण की प्रक्रिया myogenesis कहा जाता है और जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी विनियमित नियंत्रण की विशेषता है. Myogenic पुरोगामी व्यक्ती Pax3 आणि Pax7, जबकि myoblasts व्यक्ती MyoD आणि/या Myf5 आणि myocytes व्यक्ती myogenin आणि myosins२,३. मांसपेशियों की वृद्धि एक प्रक्रिया है जिसमें myofibers मौजूदा तंतुओं (हाइपरप्लासिया) में और अधिक myonuclei को शामिल करके और मांसपेशी फाइबर आकार (अतिवृद्धि) में वृद्धि से बड़ा हो जाता है4. मांसपेशियों की वृद्धि के दौरान, वहां myogenic कोशिकाओं है कि वे अंतर और स्वयं को नवीनीकृत कर सकते है में सेल गुण स्टेम है की एक स्थाई स्रोत है । इन कोशिकाओं को sarcolemma (myofiber की कोशिका झिल्ली) और बेसल लेमिना5के बीच उनके भौतिक स्थान के आधार पर उपग्रह कोशिकाओं को पद है । SCs तेजी से किशोर अवस्था (जन्मोत्तर चूहों के पहले 2-3 सप्ताह) में मांसपेशियों की वृद्धि करने के लिए योगदान है, लेकिन वयस्क मांसपेशियों6आराम में quiescent हो जाते हैं । उल्लेखनीय, वे फिर से मांसपेशियों को घायलों के जवाब में सक्रिय किया जा सकता है और नई मांसपेशी कोशिकाओं में अंतर करने के लिए क्षतिग्रस्त मांसपेशी की मरंमत7।
स्टेम सेल गुण दोनों बुनियादी मांसपेशी जीवविज्ञान और मांसपेशियों की बीमारियों के उपचार के लिए प्रासंगिक SCs का अध्ययन करते हैं8. नतीजतन, यह पिछले दशकों में गहन जांच का क्षेत्र रहा है । SCs९,१०की आनुवंशिकी और epigenetics को विदारक करने में जबर्दस्त प्रगति हुई है. सीटू में SCs को अलग और पहचानने में शामिल तकनीक विकसित की गई और11तरह से साथ अनुकूलित किया गया । Immunofluorescent धुंधला Pax7 के लिए सहित विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से SCs की पहचान की अनुमति देता है । हालांकि, कमी और SCs के छोटे आकार के एक मजबूत ऑटो प्रतिदीप्ति वयस्क कंकाल मांसपेशी ऊतक के साथ संयुक्त दृश्य चुनौतीपूर्ण प्रदान करते हैं । यहां, हम एक immunofluorescent धुंधला Pax7 के लिए माउस मांसपेशी ऊतक के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन और zebrafish मांसपेशी12के लिए एक मौजूदा पद्धति पर आधारित है । इसके अलावा, एक Laminin एंटीबॉडी एक विशिष्ट fluorophore के साथ लेबल को बेसल लेमिना जिसके तहत SCs स्थित है की पहचान करने के लिए कार्यरत है । यह प्रोटोकॉल लगातार सभी परीक्षण शारीरिक स्थितियों और विकासात्मक चरणों के तहत Pax7-सकारात्मक SCs और myogenic अग्रदूतों के दृश्य की अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल Pax7/MF20 की एक विधि पर आधारित था zebrafish कंकाल की मांसपेशी12पर धुंधला । उपयोग किए गए समाधान और ब्लॉकिंग चरण समान या समान हैं । इस्तेमाल किया एंटीबॉडी समान हैं । समायोजित कद?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माइक्रोस्कोप और तकनीकी मदद प्रदान करने के लिए NIAMS लाइट इमेजिंग अनुभाग धन्यवाद । MF20 और Pax7 एंटीबॉडी विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक के तत्वावधान में विकसित से प्राप्त किया गया और जैव विज्ञान विभाग के द्वारा बनाए रखा, आयोवा विश्वविद्यालय, आयोवा शहर । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के NIAMS के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने समर्थन दिया था.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referências
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