Endomicroscopia confocale confocale a scansione laser accoppiata a fibre in vivo (pCLE) dei capillari dell'ippocampo in topi svegli
Summary
Mentre l’imaging multifotone è efficace solo a profondità limitate dalla superficie del tessuto, è possibile ottenere immagini con risoluzione di 3 μm a qualsiasi profondità tramite pCLE. Qui, presentiamo un protocollo per condurre l’imaging pCLE per misurare la dinamica microvascolare nell’ippocampo di topi ictali e wild-type.
Abstract
L’obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere l’endomicroscopia confocale a scansione laser (pCLE) pre-clinica accoppiata a fascio ottico nella sua applicazione specifica per chiarire gli effetti del flusso sanguigno capillare durante le convulsioni, guidati da cellule murali. L’imaging corticale in vitro e in vivo ha dimostrato che le costrizioni capillari guidate dai periciti possono derivare dall’attività neurale locale funzionale, nonché dall’applicazione di farmaci, in animali sani. Qui, viene presentato un protocollo su come utilizzare pCLE per determinare il ruolo della dinamica microvascolare nella degenerazione neurale nell’epilessia, a qualsiasi profondità tissutale (in particolare nell’ippocampo). Descriviamo una tecnica di poggiatesta che è stata adattata per registrare pCLE in animali svegli, per affrontare i potenziali effetti collaterali degli anestetici sull’attività neurale. Utilizzando questi metodi, le registrazioni elettrofisiologiche e di imaging possono essere condotte per diverse ore nelle strutture neurali profonde del cervello.
Introduction
A differenza di altri metodi di imaging microscopico 1,2,3,4,5,6,7,8, la microscopia confocale in vivo basata su fibre ottiche consente di misurare la dinamica del flusso sanguigno in qualsiasi regione del cervello, a qualsiasi profondità, ad alta velocità (fino a 240 Hz a seconda delle dimensioni del campo visivo9). Una sonda a fibre ottiche consente di ottenere immagini a scansione laser confocale in vivo con una risoluzione di 3 μm perché la punta della sonda (un obiettivo senza lente costituito da un fascio di 5000-6000 singole fibre di 3 μm di diametro) può essere posizionata con la precisione di un microelettrodo, entro 15 μm dal target fluorescente di interesse. Come per l’imaging a due fotoni in vivo, i fluorofori devono essere preventivamente introdotti nel bersaglio di imaging. Ad esempio, la fluoresceina destrano (o punti quantici) può essere iniettata nel sistema vascolare, o le proteine fluorescenti geneticamente codificate possono essere trasfettate nelle cellule, o i coloranti fluorescenti come Oregon Green BAPTA-1 possono essere caricati in massa nelle cellule, prima dell’imaging.
Recenti ricerche che utilizzano queste tecniche hanno scoperto che l’attività motoria delle cellule murali che porta a vasospasmo capillare ictale – improvvise costrizioni che si verificano nella posizione delle cellule murali durante le convulsioni 9 – può contribuire alla neurodegenerazione nell’ippocampo ictale9. Mentre precedenti studi di imaging hanno mostrato costrizioni dei periciti in vitro e in vivo collegate alle applicazioni di farmaci 6,7,10,11,12, Leal-Campanario et al. hanno trovato la prima evidenza di costrizioni capillari spontanee in vivo nel cervello murino. Per stabilire la rilevanza per l’epilessia del lobo temporale umano, hanno studiato topi maschi (P30-40 old) knockout (KO) Kv1.1 (kcna1-null) 14,15 (JAX stock #003532), un modello genetico di atassia episodica umana di tipo 115. I periciti hanno provocato vasocostrizioni murali ippocampali sia patologiche che fisiologiche9 negli animali spontaneamente epilettici e nei loro compagni di cucciolata wild-type (WT). Queste osservazioni sono state replicate in animali WT resi epilettici con acido kainico, indicando così la loro generalizzazione ad altre forme di epilessia. Leal-Campanario et al. hanno inoltre determinato, utilizzando nuovi approcci di microscopia stereologica, che i neuroni apoptotici, ma non sani, negli animali epilettici erano spazialmente accoppiati alla microvascolarizzazione dell’ippocampo. Poiché l’eccitotossicità non ha alcuna associazione spaziale nota con il sistema vascolare, questo risultato ha indicato che l’ipossia indotta da ischemia vasospastica capillare anormale contribuisce alla neurodegenerazione nell’epilessia. La Figura 1 mostra uno schema della configurazione generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un sistema di ritenuta testa-cappuccio per esperimenti elettrofisiologici e pCLE simultanei a fibre ottiche in topi svegli, riducendo la potenziale contaminazione della risposta dovuta ai farmaci anestetici. Il cappuccio per la testa e l’apparato di montaggio sono semplici da costruire e sono riutilizzabili per esperimenti di imaging cronico da svegli. Abbiamo verificato la qualità delle registrazioni rispetto al gold standard per l’imaging microscopico del flusso sanguigno in vivo, TPLSM.
<p clas…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato finanziato da un premio per l’iniziativa di ricerca dell’American Epilepsy Society e da un premio della Commissione per la ricerca biomedica dell’Arizona a SLM, nonché da una sovvenzione di sfida da Research to Prevent Blindness Inc. al Dipartimento di Oftalmologia della SUNY Downstate Health Sciences University, il New York State Empire Innovation Program. e ulteriori sovvenzioni dalla National Science Foundation (0726113, 0852636 e 1523614), dalla Barrow Neurological Foundation, dai premi Mrs. Marian Rochelle, Mrs. Grace Welton e Dignity Health SEED, e da sovvenzioni federali dalla National Science Foundation (0726113, 0852636 e 1523614) e dal National Institute of Health (Awards R01EY031971 E R01CA258021), a SLM e S.M.C. Questo lavoro è stato sostenuto anche dall’Ufficio dell’Assistente del Segretario alla Difesa per gli Affari Sanitari con il Premio n. W81XWH-15-1-0138, a S.L.M.. L.-C. è stato sostenuto da una borsa di studio José Castillejo del Ministero dell’Istruzione spagnolo. Si ringraziano O. Caballero e M. Ledo per la consulenza tecnica e l’assistenza.
Materials
| 0.7 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-07 | For Screws No. 19010-00 |
| 0.9 mm diameter burr | Fine Science Tools | 19007-09 | |
| ASEPTICO AEU-12C TORQUE PLUS | from Handpiece solution | AEU12C | |
| Bull dog serrifine clump | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| CellVizio dual band | Mauna Kea Technologies | ||
| CellVizio single band | Mauna Kea Technologies | ||
| Confocal Microprobe 300 microns (Serie S) | Mauna Kea Technologies | ||
| Custom-made alignment piece | L-shaped (angled at 90 deg) and made of stainless steel with two holes drilled on it, with a 4 mm separation from center to center | ||
| Custom-made mounting bar | The long section piece of the mounting bar should be between 9.4 – 13mm. Fixed to this piece of the mounting bar, position a stainless-steel plate 1.5 cm long and 0.5 cm wide that has two holes drilled separated 4 mm from center to center, the same distance that the L-shaped alignment piece. | ||
| Cyanoacrylate adhesive-Super Glue | |||
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| DuraLay Inlay Resin – Standard Package | Reliance Dental Mfg Co. | 602-7395 (from patterson dental) | |
| Fillister Head, Slotted Drive, M1.6×0.35 Metric Coarse, 12mm Length Under Head, Machine Screw | MSC industrial direct co. | 2834117 | |
| Fine Point scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Fluorescein 5% w/w lysine-fixable dextran (2MD) | Invitrogen, USA | D7137 | |
| Halsey smooth needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kalt suture needle 3/8 curved | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting Co. 51704 | 51670 | |
| Methocel 2% | Omnivision GmbH | PZN: 04682367 | Eye ointment to prevent dryness. |
| Mouse Temperature controller, probe (YSI-451), small heating pad-TC-1000 Mouse | CWE Inc. | 08-13000 | |
| PhysioTel F20-EET transmitters | DSI | 270-0124-001 | |
| Robot Stereotaxic, Manipulator Arm, ADD-ON, 3 Axis, LEFT | Stoelting Co.C13 | 51704 | |
| Sel-Tapping bone screws | Fine Science Tools | 19010-10 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting Co | 51648 | |
| Suture Thread – Braided Silk/Size 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Tissue separating microspatula | Fine Science Tools | 10091-121 |
Referências
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