Vi presenterade här, metoderna för att upptäcka mänsklig islet autoantikroppar använder elektrokemiluminescens (ECL) analyser. Protokollet, som används för att förutsäga typ 1-diabetes kan utökas på att upptäcka autoantikroppar för andra autoimmuna sjukdomar.
Precisera islet autoantikroppar associerade med typ 1-diabetes leder (T1D) till projektet och avskräcka denna sjukdom i befolkningen. En roman ECL-analysen är en nonradioactive vätska fas analysen för islet autoantikroppar med högre sensitivitet och specificitet än den nuvarande ‘guld’ standard radio-bindande assay (RBA). ECL-analyser kan mer exakt definiera uppkomsten av presymtomatiska T1D genom att skilja på hög risk, hög affinitet autoantikroppar från de låg risk, låg affinitet autoantikroppar som genereras i RBAs och konventionella enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA ). Proteinet antigen som används i denna ECL analys är märkt med Sulfo-tag och Biotin, respektive. Varje analys av ECL-autoantikropp som använder ett visst antigen protein behöver en optimering steg innan det kan användas för laboratoriet ansökan. Detta är särskilt viktigt att fastställa kraven för serum syra behandlingar, koncentrationer och nyckeltal av två olika antigener märkt med Sulfo-tag och Biotin. För att utföra analysen, serum prover blandas med Sulfo-tag-konjugerad och biotinylerade capture antigen protein i fosfatbuffrad lösning (PBS), som innehåller 5% bovint serumalbumin (BSA). Efteråt, proverna inkuberas över natten vid 4 ° C. Samma dag en streptividin-belagda platta bereds med blockerare buffert och inkuberas över natten vid 4 ° C. På den andra dagen, tvätta streptividin plattan och överföra serum-antigen blandningen på plattan. Placera plattan på plattan shaker, sätta den på låg hastighet och inkubera i rumstemperatur i 1 h. Därefter plattan sköljs igen, och läsaren buffert tillsätts. Plattan räknas sedan på plattan läsaren maskinen. Resultaten förmedlas genom ett index, som genereras från standard positiva och negativa internkontroll serumprov.
Ett nyligen mellanlagringsplatsen klassificeringssystem har skapats för att hjälpa till med diagnos av inledande skedena av T1D hos patienter. Exakt detektion av mänskliga islet autoantikroppar spelar en viktig roll i att identifiera och iscensättning presymtomatiska typ 1-diabetes, som förekomsten av islet autoantikroppar anger förekomsten av β-cellen autoimmunitet. Som diabetes påverkar patienter från den första förekomsten av β-cellen autoimmunitet till symtomatisk sjukdom, associerat med antal och typ av islet autoantikroppar, är variabel2,3.
Åldern av autoantikroppar serokonversion, titer och affinitet islet autoantikroppar kan påverka graden av progression till symtomatisk typ 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Nyligen utvecklade ECL analyser har validerats i stor utsträckning, har visat ökad känslighet, och är mer sjukdomsspecifika10,11,12,13. Dessa analyser förbättrar prognos och iscensättning av diabetes risken genom tidigare upptäckt av islet autoantikroppar. De mer exakt Markera inledandet av islet autoimmunitet och ignorera de låg affinity och låg risk signalerna inte är relevanta för diabetes.
I ett ECL test, autoantikroppar i serum, om närvarande, överbrygga Sulfo-tag-konjugerad antigen till biotinylerade capture antigen i den flytande fasen. Efter bryggning, är Biotin länkaren fångad i den fasta fasen och upptäcks genom ECL av Sulfo-etiketten på streptividin belagda plattan (figur 1).
I denna översyn utnyttjas främst enda antikropp ECL analyser med mänskliga islet autoantikroppar. Kort, multiplexed antikropp analyser baserat på enda ECL analyser kommer att diskuteras. Multiplex analysen kan användas för att identifiera flera, upp till 10, autoantikroppar inom en enda väl, använder 15 µL serum. Denna enkla hög genomströmning analys kan användas att gallra, samtidigt flera autoantikroppar för flera relevanta autoimmuna sjukdomar i befolkningen.
Islet autoantikroppar är för närvarande de mest tillförlitliga biomarkörer för autoimmunitet av typ 1-diabetes. De Markera uppkomsten av holme specifika autoimmunitet och bestämma uppenbara sjukdomsrisker. ECL analysen, för islet autoantikroppar, har validerats i stor utsträckning i flera nationella och internationella typ 1 diabetes kliniska prövningar. Analysen har visat ökad känslighet och specificitet jämfört med nuvarande ‘guld’ standard RBAs. ECL analysen har visat dess överlägsna fördel för högre sjukdom specificitet av diskriminerande hög affinitet och hög risk islet autoantikroppar från låg risk, låg affinitet signaler som genereras av RBA. Detta märks särskilt i ämnen som är endast enstaka islet autoantikroppar positiva och har aldrig kommit för att typ 1-diabetes. De flesta av dessa låg affinitet autoantikroppar befanns vara förlorade under uppföljning test gjort inom månader till år, beter sig som en ‘övergående positiva ”. Som tidigare hypoteser, dessa låg affinitet ‘enda’ autoantikroppar sannolikt resulterat från immunisering med en korsa-reactive molekyl. Samtidigt högre affinitet resulterade högre risk islet autoantikroppar från immunisering med holme antigenerna själva. Dessutom har ECL-analyser visat förmåga att uppkommit före tidpunkten för ‘serokonversion’ från radio-bindande nuvarande standardanalyser (RBA) med åren hos barn med pre-diabetes, som följdes till kliniska diabetes från födseln. En pågående internationella kliniska prövningen, The miljömässiga bestämningsfaktorer till Diabetes i ung (nallen), beror på korrekt upptäckt att precisera timing och utseendet på första islet autoantikroppar ‘serokonversion’ för att markera början av holme Autoimmunitet och för att identifiera miljömässiga triggers. En möjlig orsak till ökad känslighet i ECL-analysen är att analysen fångar alla immunglobulin klasser: IgG, IgM, IgA, eller IgE, snarare än traditionella RBA eller ELISA som förlita sig enbart på detektion av IgG.
I ECL analyser, för vissa specifika autoantikroppar som IAA, tycks bindningen av autoantikroppar mot antigenet hämmas av någon komponent som finns i normala humanserum. Ta bort eller släppa denna hämning, var syrabehandling av serumprover nödvändigt att göra innan serum var inkuberas med antigen. Som visas i [figur 5], ECL-IAA assay stärktes kraftigt både mus insulin monoklonala antikroppen och patienternas serum autoantikroppar med antigenet bindande verksamhet. Försurning av serumprov, används i antikropp-analyser, används vanligtvis för att avassociera redan existerande bundna komplex. Mekanismen bakom hur IAA signaler är hämmade i humant serumprover och släpptes av försurning av serum är inte känt, men denna metod har använts i andra ECL baserat analyser14,15.
I några fall, när märkning molekyler, är antingen Biotin eller Sulfo-tag, den märkning positionsinside av antigen proteinmolekyler på eller mycket nära viktiga epitoper av antikropp bindande, som kan störa aktiviteten bindning till antikroppar. Detta kommer att minska analysens känslighet och kan helt riva ner analysen. För rutin märkning förfarande, önskas maximering eller mättnad för varje antigen proteinmolekyl att generera maximal aktivitet eller signal per märkt molekyl genom att maximera märkning kapacitet av varje möjligt märkning ställning. Omättade märkning ska utföras genom att minska molar förhållandet märkning molekyler (Biotin och Sulfo-tag) till proteinet antigen om märkning på antigen blir en möjlig orsak till avbrott av antikropp bindande aktivitet. Major epitoper kan reserveras bättre och avbrott av antikropp bindande aktivitet kan frigöras med omättade märkning strategin i de flesta fall.
Varje assay bör inkludera intern standard hög positiv och negativ kontroll för indexberäkningarna okända prover. En låg positiv kontroll nära analysens övre gränsen för normala kontroller är viktigt att inkludera för övervakning av analysens känslighet. Laboratoriet bör hålla tillräckligt alikvoter av standard positiva och negativa kontroller för långtidsanvändning och alla portioner ska förvaras vid-20 ° C. För analysens kvalitetssäkring, analyser måste köras i dubbletter för varje prov och varje positivt resultat bör bekräftas genom att upprepa provet i en separat analys. En tredje analys är nödvändiga när den andra bekräftande analysen inte håller med den första analysen och resultaten av två analyser, som håller (t.ex., +, + eller-, -), kommer att vara det slutgiltiga fastställandet av ett positivt eller negativt resultat.
Med plattformen för enda ECL analyser, utökas en multiplex assay vid från dessa. Samtidigt kan den bestämma upp till 10 olika autoantikroppar i en enda brunn med en liten mängd serum. För närvarande är fyra islet autoantikroppar inklusive IAA, GADA, IA-2A och ZnT8A lika betydelse för risk förutsägelse av progression till T1D i både släktingar av patienter med T1D och den allmänna befolkningen. De metoder som används för screening av dessa 4 autoantikroppar med nuvarande enda autoantikropp mätningar är mödosam och ineffektiva, särskilt för storskaliga allmän screening. Ännu viktigare, upp till 40% av patienter med T1D har en ytterligare autoimmuna tillstånd16,17,18. Tyvärr finns det inget enkelt och billigt verktyg till skärmen för dessa förhållanden. Multiplex ECL analysen klarar inte bara av att kombinera 4 nuvarande stora islet autoantikroppar analyser till en, men är också kunna ytterligare kombinera fler autoantikropp analyser från andra relevanta autoimmuna sjukdomar. Detta gör det möjligt att effektivt genomföra high throughput screening för flera autoimmuna sjukdomar samtidigt i stor skala populationer. I multiplex ECL-analysen, som visas i [figur 6], kommer att varje antikropp-antigen komplex bildades den vätska-fasen vara återhållsamma till en specifik linker källa plats i samma väl. Signalmottagaren på plattan läsaren maskinen är kunna känna igen signalerna från 10 olika källor av fläckar. Men kan fläckarna med en extremt hög signal generera en hög assay bakgrund och orsakar störningar i närliggande ställen via överhörning. Därför bör signalerna som övre gräns för varje autoantikropp assay begränsas till färre än 20 000 räknas. Vår erfarenhet bör av autoantikroppar med lägre bakgrunder placeras relativt långt bort från dessa ställen med högre räknas när plats karta är utformad. För långsiktiga studier använder multiplex ECL analyser, rekommenderas det att samma länkaren användas för samma autoantikropp analysen för att hålla analysen konsekvent.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH bevilja DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.
Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
HCl | Fisher | A144-500 | |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |