Пользовательские инженерных форм культуры ткани от мастеров лазером
Summary
Здесь мы представляем быстрым, легким и лоу кост метод для изготовления форм пользовательских полидиметилсилоксан, которые могут использоваться для производства на основе гидрогеля инженерии тканей со сложной геометрией. Мы дополнительно описать результаты от механических и гистологической оценок, проводимых на инженерии сердечной ткани производятся, используя эту технику.
Abstract
В области тканевой инженерии продолжает Зрелые, наблюдается повышенный интерес в широком диапазоне параметров ткани, включая ткани форму. Манипулируя ткани форму на Микрометр сантиметр масштаба можно прямое выравнивание ячейки, изменять эффективные механические свойства и рассмотреть ограничения, относящиеся к диффузии питательных веществ. Кроме того судно, в котором готовится ткани может распространять механических ограничений на ткани, привело поля напряжений, которые далее могут влиять на структуру клеток и матрицы. Фасонные ткани с высокой воспроизводимости измерений также есть утилита для анализов в пробирке в котором образца размеры имеют решающее значение, таких как механический анализ всей ткани.
Эта рукопись описывает метод альтернативного изготовление, используя отрицательные мастер формы, приготовленный из лазером акриловые: эти формы выполняют хорошо с полиэфиром (PDMS), разрешение конструкции с размерами на сантиметр масштаба и функция размеры меньше, чем 25 мкм и может быть быстро разработаны и изготовлены по низкой цене и с минимальным опытом. Минимальное время и стоимость требований позволяют для лазерных травленная прессформы быть быстро итерации по пока не определен оптимальный дизайн и быть легко адаптированы для любого анализа интерес, в том числе за пределами области тканевой инженерии.
Introduction
За последние два десятилетия мягкие литографии как изготовление техника широко используется для поддержки научных исследований, особенно в областях микрофлюидика, материалы исследований и ткани инженерных1,2, 3. Литье реплики, в которой создается объект с желаемой формы от негативных мастер плесень, предлагает удобный и недорогой метод производства положительная PDMS реплицирует который может использоваться для литья в форме гидрогели. Однако требуется негативные мастер формы обычно производятся с использованием микротехнологий методов, которые стоят дорого, много времени, ограничены по размеру, и требуют пространство комнаты и сложного оборудования. В то время как 3D печати предлагает потенциальной альтернативой, его полезность несколько ограничены из-за пределы резолюции недорогих принтеров и химических взаимодействий между общей 3D принтер полимеров и PDMS, которые могут препятствовать отверждения.
Лазерный резак системы способны как резки и травления такие материалы, как пластик, дерево, стекло и металл в последнее время стали значительно менее дорогостоящими и поэтому более доступными для изготовления инструментов исследования. Коммерческого класса Лазерные резаки способны сфабриковать объектов на шкале сантиметр с минимумом функций менее 25 мкм и далее требуют минимальной подготовки, опыта и времени для использования. В то время как лазерной абляции PDMS ранее использовался при изготовлении устройств микрофлюидика, наши знания не рукопись описал процесс, по которому миллиметр и сантиметр масштаба формы могут быть изготовлены из лазерной резки негативных мастер формы4 .
Мы использовали этот метод прежде всего для того, чтобы манипулировать форму инженерии тканей с целью улучшения питательных диффузии, сотовой выравнивание и механические свойства5,6,7. Однако для использования в любой области, где формованные гидрогели представляют интерес, например наркотиками доставки и материал науки исследований8позволяет универсальность этой техники. С доступ к лазерный резак, реплицирует PDMS плесень могут быть сделаны для почти любой геометрии без свесы (которые будет препятствовать удалению без многодетальном плесень, которая выходит за рамки этой рукописи) и что вписывается в габариты кровати лазера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Заказной PDMS плесень геометрии, которые совместимы с тканевой культуры имеют большое утилита настройки важных инженерных ткани свойства, такие как выравнивание ячеек, скорость диффузии и эффективной жесткость. Кроме того эти формы являются очень полезными для подготовки ткани для ана?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, финансирование из низ R00 HL115123 и Браун университета школа инженерии. Они также благодарны Браун Дизайн семинар и Крис Bull для профессиональной подготовки и поддержки с лазерной резки.
Materials
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
Referências
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
