محددة و "دقيقة كشف" spp. "الحمضيات تخضير الممرض" ليبيريباكتير Candidatus استخدام PCR التقليدية على "عينات الأنسجة أوراق الحمضيات"
Summary
تخضير الحمضيات مرض لا سيما مدمرة التي تؤثر على المحاصيل الحمضيات على الصعيد العالمي. المقدمة هنا هو طريقة بسيطة باستخدام PCR واستخراج الحمض النووي الجينومي أنسجة أوراق الحمضيات لتحديد مسببات المرض تخضير الحمضيات، Candidatus ليبيريباكتير spp. صحيحة ودقيقة
Abstract
تخضير الحمضيات، المعروف أيضا هوانجلونجبينج، مرض الحمضيات مدمرة يجتاح مزارع الحمضيات على الصعيد العالمي. يسبب هذا المرض فالفليورايد ليف أصفر غير متناظرة الوريد اصفرار وتساقط الأوراق، تسوس الجذر، وفي نهاية المطاف، موت النبات الحمضيات. عند إصابة، قد توقف نمو النباتات الحمضيات وإنتاج الزهور خارج الموسم. هذه الزهور نادراً ما تعطي ثمارها، وتلك التي تدر الحمضيات الصغيرة، والمريرة، وشكل غير منتظم على شكل غير مرغوب فيه. وينتشر هذا المرض بسيليد الحمضيات الآسيوية، سيتري ديافورينا، وتطعيم الأنسجة الحمضيات المصابة. مسببات المرض بفترة حضانة طويلة ومتغير داخل المصنع الحمضيات – أحياناً سنوات، قبل أن تظهر الأعراض. محاولات للثقافة هذا الممرض في المختبر لم تكلل بالنجاح، ربما بسبب الانخفاض وتركيز متفاوت من مسببات المرض داخل إصابة الأنسجة الحمضيات، أو لأنه من الصعب إجراء نسخ متماثل البيئية ظروف مواتية لنمو مسببات المرض. من الصعب جداً تحديد المرض قبل أن ينتشر، بسبب فترة الحضانة الطويلة وعدم قدرة الباحثين على ثقافة الممرض. نتيجة لذلك فقط يصبح المرض الظاهر بعد تدمير كامل الغلة مزارع الحمضيات فجأة. قدم هنا وسيلة للكشف عن مسببات المرض تخضير الحمضيات، Candidatus ليبيريباكتير spp. باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الجينومي وبكر دقيقة ومحددة. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف للتحليل الكمي. هذا الأسلوب يمكن تكييفها للاستخدام على أي أنسجة الحمضيات؛ ومع ذلك، يحتمل أن تكون محدودة بمقدار الممرض في الأنسجة. على الرغم من ذلك، هذا الأسلوب سوف تسمح لمزارعي الحمضيات على تحديد النباتات الحمضيات المصابة في وقت سابق، وكبح انتشار هذا المرض المدمر قبل فإنه يمكن زيادة انتشار.
Introduction
تخضير الحمضيات، يعرف أيضا باسم هوانجلونجبينج، تسببت في خسارة كبيرة من أشجار الحمضيات. حالة ممثلة واحدة هي ولاية فلوريدا، حيث المرض ومن المتوقع أن يسبب انخفاض بنسبة 70% في إنتاج مربعات فلوريدا البرتقال من مربعات 244 مليون في الموسم 1997-1998 إلى مربعات 70 مليون حتى موسم 2016-20171. ما يزيد على 90 في المائة أشجار الحمضيات في فلوريدا المصابة2، ويقدر أن صناعة الحمضيات في فلوريدا يفقد حوالي 1 بیلیون دولار أمريكي كل عام بسبب أمراض الحمضيات، حيث يلعب تخضير الحمضيات بدور رئيسي3. تخضير الحمضيات وينتشر أساسا عن طريق بسيليد الحمضيات الآسيوية الغازية سيتري ديافورينا، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر بتطعيم الأنسجة المصابة. هذا المرض يسبب اصفرار عروق فالفليورايد ليف أصفر غير متناظرة، تساقط الأوراق قبل الأوان، وسقم غصين، تسوس الجذر والموت من المصنع. الأهم من ذلك، يتسبب المرض مصنع الحمضيات لإنتاج الزهور خارج الموسم، التي نادراً ما تنتج الفاكهة. الثمرة التي تنتجه مصانع الحمضيات المصابة غير ناضجة، والأخضر، ومريرة تذوق4.
والغرض من هذا الأسلوب هو دقة ودقة التعرف بكتيريا متحركة Candidatus ليبيريباكتير spp.، المسبّب تخضير الحمضيات، الذين يعيشون داخل لحاء أشجار الحمضيات المصابة5. يتم استخراج الحمض النووي من نبات كامل الأنسجة، والتي تحتوي على البكتيريا الحية. يتم استخدام هذا الحمض النووي المستخرج كقالب لبكر التقليدية، حيث تستخدم النوكليوتيد مكملة ل 16S المتاشب تسلسل هذه البكتيريا لتضخيم هذا التسلسل. وتستخدم كعنصر تضخيم داخلية النوكليوتيد مكملة لجين فب الحمضيات. لقد اخترنا لاستخدام هذا الأسلوب، لأنه قد ثبت نجاحها في البحوث السابقة6.
يحتوي هذا الأسلوب ميزة واضحة بسيطة وغير مكلفة نسبيا، وقادرة على القيام بها في أي مختبر الكيمياء الحيوية مجهز بشكل طبيعي. وبالإضافة إلى ذلك، يبقى PCR الأسلوب الأكثر دقة ودقيقة للكشف عن هذه العوامل الممرضة، نظراً لصعوبة استزراع هذا الممرض7، والممرض القدرة على البقاء على قيد الحياة وتتكاثر لسنوات داخل مضيف أعراض8. وقد استخدمت العديد من التخصصات المختلفة PCR فحوصات بنجاح الكشف عن مسببات هذا المرض؛ بيد أن بكر التقليدية لا تزال المقايسة أبسط للكشف دقيقة ومحددة، لا سيما داخل المضيفين أعراض8.
Protocol
Representative Results
Discussion
من الأهمية بمكان أن يتم اتباع جميع الخطوات بالضبط لتحقيق أفضل الظروف التجريبية. تم استخدام أنسجة نبات كامل خلال هذه التظاهرة؛ ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول نظرياً تضمين أي نوع من الأنسجة النباتية. سابقا، الباحثين استخراج الحمض النووي من نبات الوريد الأنسجة، بدلاً من أنسجة نبات كامل، وت?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وضع إطار مفاهيمي وم. ز. س. ف.؛ التحقيق وجيم حاء ج. ج. ز. س. و. الموارد، ف. س. ز.؛ كتابة-المشروع الأصلي، أولاً ألف ص؛ كتابة – المراجعة والتحرير، ص أولاً ألف وجيم ياء وجيم حاء، س. ل. ت. وز. س. ف.؛ التصور، وجيم حاء؛ الإشراف، ف. س. ز.؛ الحصول على التمويل، و س. ز. و. ل. س. ف.
مشروع يدعمه “ولاية كارولينا الجنوبية تحسين المعلم جودة التعليم العالي الدولة منحة” بعنوان وعمليات المعارف النباتية تعزيز الأوسط درجات العلوم للمعلمين، والهياكل والمهام من خلال المشاركة في “بحوث علوم النبات” (نبات العلوم)
الأموال التي تمنحها “المتحدة الولايات إدارة التعليم” (رقم كفدا 84.367B)
الكتاب أود أن أشكر الدكتور وانغ نيان من جامعة فلوريدا لتقديم عينات الحمض النووي الجينومي من إصابة فالنسيا سينينسيس الحمضيات .
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
