Specifieke en nauwkeurige detectie van de Citrus vergroening Pathogen Candidatus liberibacter spp. gebruikend conventionele PCR op Citrus blad weefselsteekproeven
Summary
Citrus “vergroening” is een bijzonder destructieve ziekte die citrusvruchten wereldwijd. Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode om met behulp van PCR en genomic DNA-extractie van citrus blad weefsel voor de nauwkeurige en precieze identificatie van het pathogeen citrus vergroening, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Citrus “greening”, ook bekend als huanglongbing, is een destructieve citrus ziekte teistert citrus bedrijven wereldwijd. Deze ziekte veroorzaakt asymmetrische geel blad patroon, ader vergeling, naald-of bladverlies, root verval en uiteindelijk de dood van de citrus plant. Wanneer septisch, de citrus planten groei hebben onvolgroeide en produceren bloemen buiten het seizoen. Deze bloemen opbrengst zelden fruit, en die kleine, bittere, onregelmatig gevormde citrusvruchten die opbrengst zijn niet wenselijk. Deze ziekte wordt verspreid door de Aziatische citrus psyllid, Diaphorina citri, en door het enten van geïnfecteerde citrus weefsel. Het pathogene agens heeft een lange en variabele incubatietijd binnen de citrus plant — soms jaren voordat de symptomen verschijnen. Pogingen om deze pathogenen in vitro cultuur zijn mislukt, mogelijk vanwege de lage en ongelijke concentratie van het pathogene agens binnen citrus weefsel besmet, of omdat het moeilijk is om te repliceren de milieu dat bevorderlijk is voor groei van voorwaarden het pathogene agens oplevert. Het is erg moeilijk om de ziekte identificeren voordat het heeft verspreid, als gevolg van de lange incubatietijd en onderzoekers onvermogen om de cultuur van het pathogene agens oplevert. Dientengevolge, blijkt de ziekte alleen na plotseling citrus akkerbouwer de gehele oogst te vernietigen. Hier gepresenteerd is een methode voor de detectie van het nauwkeurig en specifiek voor de citrus vergroening pathogen, Candidatus liberibacter spp. met behulp van een genomic DNA-extractie kit en PCR. Deze methode is eenvoudig, efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik op elke citrus weefsel; het is echter mogelijk beperkt door de hoeveelheid pathogen in het weefsel aanwezig. Echter zal deze methode toelaten citrus boeren eerder identificeren van besmette citrus planten, en beteugelen van de verspreiding van deze destructieve ziekte voordat het verder kan verspreiden.
Introduction
Citrus “greening”, ook bekend als huanglongbing, heeft geleid tot een aanzienlijk verlies van citrusbomen. Één vertegenwoordiger geval is Florida, waar de ziekte is voorspelde een 70% daling in de productie van Florida oranje dozen van 244 miljoen dozen in het seizoen 1997-1998 te bezorgen 70 miljoen dozen vanaf het seizoen 2016-20171. Meer dan 90% van citrusbomen in Florida zijn geïnfecteerde2, en geschat wordt dat de Florida citrus industrie ongeveer een miljard dollar per jaar als gevolg van citrus ziekten verliest, waarin citrus “vergroening” een belangrijke rol-3 speelt. Citrus groener wordt verspreid voornamelijk door de invasieve Aziatische citrus psyllid Diaphorina citri, maar kan ook worden verspreid door enting van geïnfecteerd weefsel. De ziekte veroorzaakt geelverkleuring van de aderen, asymmetrische geel blad patroon, voortijdig naald-of bladverlies, takje zullen verdwijnen, root verval en dood van de plant. Belangrijk is dat veroorzaakt de ziekte de citrus plant produceren bloemen buiten het seizoen, die zelden fruit produceren. Het fruit dat wordt geproduceerd door geïnfecteerde citrus planten zijn onvolwassen, groen en bittere proeven4.
Het doel van deze methode is om nauwkeurig en precies identificeren de motile bacterie Candidatus liberibacter spp., de verwekker van citrus vergroening, wonen in het floëem van besmette citrusbomen5. Genomic DNA wordt geëxtraheerd uit het hele blad weefsel, waarin de levende bacteriën. Deze uitgepakte genomic DNA wordt gebruikt als een sjabloon voor conventionele PCR, waar oligonucleotides aanvulling op van de bacterie 16S rDNA volgorde worden gebruikt om te versterken deze volgorde. Oligonucleotides complementair aan een citrus FBOX -gen worden gebruikt als een versterking van de interne controle. We kozen voor deze methode, omdat het heeft bewezen succesvol te zijn in vorige onderzoek6.
Deze methode heeft het duidelijk voordeel dat ze kunnen worden uitgevoerd in een normaal uitgeruste biochemie-lab, eenvoudig en relatief goedkoop. Daarnaast blijft de PCR de nauwkeurigste en meest nauwkeurige methode voor het opsporen van deze pathogenen, als gevolg van de moeilijkheid van het kweken van deze ziekteverwekker7, en het pathogene agens van vermogen om te overleven en te reproduceren voor jaren binnen een asymptomatische host8. Veel verschillende specialiteit PCR testen zijn gebruikt om met succes het detecteren van deze pathogene agens oplevert; conventionele PCR blijft echter de eenvoudigste bepaling voor de accurate en specifieke detectie, vooral binnen de asymptomatische hosts8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is van cruciaal belang dat alle maatregelen worden gevolgd als u precies wilt bereiken van optimale proefomstandigheden. Hele blad weefsel werd gebruikt tijdens deze demonstratie; het protocol kan echter worden gewijzigd theoretisch tot elk soort weefsel van de plant. Eerder, hebben de onderzoekers genomic DNA geëxtraheerd uit blad ader weefsel, in plaats van hele blad weefsel, en bereikt soortgelijke resultaten11. Indien de band die overeenkomt met de citrus FBOX -gen niet verschijn…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conceptualisering, H.C. en Z. v. F.; Onderzoek, H. C., J. C en Z. Q. F; Middelen, Z. v. F.; Schrijven – originele ontwerp, I. A. P.; Schrijven – Review & bewerken, I. A. P., J. C. H. C., S. L. T. en Z. v. F.; Visualisatie, H. C.; Toezicht, Z. v. F.; Financiering van de overname, Z. Q. F en F. v. L.
Project ondersteund door een South Carolina verbetering leraar kwaliteit hogeronderwijs staat subsidie getiteld verbetering van middelste rangen Science Teachers kennis van de processen van de Plant, structuren en functies door middel van betrokkenheid in wetenschappen plantenonderzoek (Plant Science)
Fondsen die zijn toegekend door de Verenigde Staten ministerie van onderwijs (CFDA nummer 84.367B)
De auteurs bedank Dr. Nian Wang van de Universiteit van Florida voor het verstrekken van genomic DNA-monsters besmet uit Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
