Spécifique et une détection précise de Using PCR classique sur des échantillons de tissus foliaires agrumes Citrus Greening pathogène Candidatus liberibacter spp.
Summary
Citrus Greening est une maladie particulièrement destructeur qui affectent les cultures agrumes dans le monde. Présenté ici est une méthode simple à l’aide de PCR et l’extraction d’ADN génomique du tissu foliaire agrumes pour l’identification exacte et précise de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, est une maladie agrume destructeur ravage fermes agrumes dans le monde. Cette maladie provoque la feuille jaune asymétrique marbrures, jaunissement de la veine, défoliation, pourriture de la racine et en fin de compte, la mort de la plante agrume. Lorsque infecté, les agrumes ont un retard de croissance et produisent des fleurs hors saison. Ces fleurs donnent rarement des fruits, et ceux qui donneront agrumes petit, amer, de forme irrégulière qui ne sont pas souhaitables. Cette maladie se propage par le psylle agrume asiatique, Diaphorina citri et par la greffe de tissus agrumes infectés. L’agent pathogène a une incubation longue et variable au sein de l’usine agrume — parfois années, avant l’apparaissent des symptômes. Tentatives de culture ce pathogène in vitro n’ont pas réussis, peut-être en raison de la faible et inégale concentration de l’agent pathogène dans les infectés tissu agrume, ou parce qu’il est difficile de reproduire l’environnement conditions propice à la croissance de l’agent pathogène. Il est très difficile d’identifier la maladie avant elle s’est répandue, en raison de sa longue période d’incubation et l’incapacité des chercheurs à la culture de l’agent pathogène. En conséquence, la maladie ne devient apparente après avoir détruit soudainement rendement entier d’agrumes de l’agriculteur. Présenté ici est une méthode pour la détection précise et spécifique de l’agent pathogène citrus greening, Candidatus liberibacter spp., à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique et de la PCR. Cette méthode est simple, efficace, rentable et adaptable pour l’analyse quantitative. Cette méthode peut être adaptée pour une utilisation sur n’importe quel tissu agrume ; Toutefois, il est potentiellement limitée par la quantité d’agents pathogènes présents dans les tissus. Néanmoins, cette méthode permettra d’agrumes aux agriculteurs d’identifier plus tôt les agrumes infectés et freiner la propagation de cette maladie destructrice avant elle peut se propager plus loin.
Introduction
Citrus greening, également connu sous le nom de huanglongbing, a causé une perte importante de citronniers. Un cas représentatif est en Floride, où la maladie est prévue pour causer une réduction de 70 % dans la production de boîtes de Florida orange de 244 millions de boîtes dans la saison 1997-1998 à 70 millions de boîtes à partir de la saison 2016-20171. Plus de 90 % des agrumes en Floride sont infectés2, et on estime que l’industrie des agrume Floride perd environ 1 milliard de dollars chaque année en raison de maladies agrumes, dans lequel les citrus greening joue un rôle de premier plan3. Citrus greening se propage principalement par l’envahissant psylle agrume asiatique Diaphorina citri, mais peut également se propager par la greffe de tissus infectés. La maladie provoque le jaunissement des nervures, feuille jaune asymétrique marbrures, défoliation prématurée, brindille dépérissement, pourriture de la racine et mort de la plante. Ce qui est important, la maladie provoque la plante agrume à produire des fleurs hors saison, qui produisent rarement des fruits. Le fruit qui est produit par les plantes agrumes infectés est immatures, vert et amer dégustation4.
Le but de cette méthode est à avec précision et identifier précisément la bactérie motile Candidatus liberibacter spp., l’agent causal de citrus greening, vivant dans le phloème d’arbres agrumes infectés5. L’ADN génomique est extraite des tissus des feuilles entières, qui contient des bactéries vivantes. Cet extrait d’ADN génomique est utilisé comme modèle pour la PCR classique, où des oligonucléotides complémentaires à la séquence de l’ADNr 16 s de la bactérie sont utilisées pour amplifier cette séquence. Des oligonucléotides complémentaires à un gène FBOX agrume sont utilisés comme un témoin d’amplification interne. Nous avons choisi d’utiliser cette méthode, car il a été prouvé pour réussir dans la recherche précédente6.
Cette méthode a l’avantage d’être simple, relativement peu coûteux et apte à être jouée dans n’importe quel laboratoire de biochimie normalement équipée. En outre, la PCR reste la méthode plus précise et exacte pour la détection de ce pathogène, en raison de la difficulté de cultiver ce pathogène7et la capacité de l’agent pathogène pour survivre et se reproduire pendant des années au sein d’un hôte asymptomatiques8. Nombreux essais PCR de spécialité différents ont été utilisés pour détecter avec succès ce pathogène ; Cependant, PCR classique reste le plus simple test pour la détection précise et spécifique, en particulier dans les hôtes asymptomatiques8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel que toutes les étapes sont suivies exactement pour obtenir les meilleures conditions expérimentales. Feuilles entières a été utilisé au cours de cette manifestation ; Toutefois, le protocole peut être modifié pour inclure théoriquement n’importe quel type de tissus végétaux. Auparavant, les chercheurs ont extrait l’ADN génomique de veine les tissus foliaires, plutôt que des tissus de feuilles entières et obtenu des résultats similaires11. Si la bande correspond…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conceptualisation, H.C. et Z. Q. F. ; Enquête, H. C., J. C et Z. Q. F ; Ressources, Z. Q. F. ; Ecriture – projet Original, I. A. P. ; Rédaction-révision et édition, I. A. P., j. C., C. H., S. L. T. et Z. Q. F. ; Visualisation, H. C. ; Supervision, Z. Q. F. ; Financement d’Acquisition, Z. F. Q. et F. Q. L.
Projet soutenu par une South Carolina améliorer enseignant qualité enseignement supérieur État subvention intitulée amélioration Middle Grades Science Teachers’ connaissance des procédés de l’usine, Structures et fonctions grâce à l’Engagement in Plant Sciences Research (plante Science)
Fonds alloués par la United États Department of Education (CFDA numéro 84.367B)
Les auteurs tiennent à remercier m. Nian Wang de l’Université de la Floride pour fournir des échantillons d’ADN génomiques d’infecté Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
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- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
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