Cítrica Greening é uma doença particularmente destrutiva afetando culturas cítricas globalmente. Apresentado aqui é um método simples usando PCR e extração de DNA genômica de tecido foliar de citrinos para a identificação precisa e exacta do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp.
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Artigo de método
Específicos e detecção precisa do Using PCR convencional em amostras de tecido de folhas cítricas cítricas Greening patógeno Candidatus liberibacter spp.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Cítrica greening, também conhecida como Greening, é uma doença de citrino destrutiva devastando fazendas cítricas globalmente. Esta doença causa manchas assimétrica folha amarela, veia amarelamento, desfolha, cárie de raiz e, finalmente, a morte da planta cítrica. Quando infectadas, as plantas cítricas têm atrofiado crescimento e produzem flores fora de época. Estas flores raramente produzem frutos, e aqueles que produzem frutas cítricas pequenas, amargas, de forma irregular que não são desejáveis. Esta doença é transmitida pelos asiáticos citrinos psilídeos, Diaphorina citri e o enxerto de tecido infectado de citrino. O patógeno tem um período de incubação longo e variável dentro da planta de citros — às vezes anos, antes que os sintomas apareçam. Tentativas de cultura esse patógeno em vitro foram infrutíferas, possivelmente devido a baixa e desigual concentração do patógeno dentro infectado tecido cítrico, ou porque é difícil replicar o ambiental condições favorável para o crescimento de o patógeno. É muito difícil identificar a doença antes que ela se espalhou, devido ao seu longo período de incubação e a incapacidade dos investigadores à cultura do patógeno. Como resultado, a doença só se torna aparente depois de repente destruindo todo rendimento do agricultor um citrino. Apresentado aqui é um método para a deteção de precisa e específica do patógeno ecologização citros, Candidatus liberibacter spp. usando um kit de extração de DNA genômico e PCR. Este método é simples, eficiente, rentável e adaptável para análise quantitativa. Esse método pode ser adaptado para uso em qualquer tecido de citrino; no entanto, potencialmente é limitada pela quantidade de patógenos presentes no tecido. No entanto, esse método permitirá citros agricultores identificar plantas cítricas infectadas anteriormente e conter a disseminação desta doença destrutiva antes de ele pode espalhar ainda mais.
Introdução
Cítrica greening, também conhecida como Greening, causou uma perda significativa de árvores de citrinos. Um caso representativo é Flórida, onde a doença está prevista para causar uma redução de 70% na produção de caixas de laranja Florida de 244 milhões de caixas na temporada 1997-1998 para 70 milhões de caixas a partir da temporada de 2016-20171. Mais de 90% das árvores cítricas na Flórida são infectadas2, e estima-se que a indústria de citros Florida perde cerca de 1 bilhão de dólares cada ano devido a doenças cítricas, onde cítrica greening desempenha um papel importante3. Cítrica greening é es....
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Protocolo
1. isolar o DNA genômico de tecidos vegetais, usando um Kit de extração de genômica
- Obter o tecido foliar cítricas cortando uma toda nova folha de uma árvore citros usando a tesoura limpa e coloque a folha em um saco plástico limpo.
Nota: A bolsa contendo o tecido foliar deve ser colocada em um frigorífico de 4 ° C ou em gelo em um recipiente isolado logo que possível após a coleta para evitar a deterioração. - Adicione uma pequena quantidade de nitrogênio líquido para acalmar um almofariz e um pilão. Enquanto eles são de arrepiar, use uma tesoura para cortar um pequeno pedaço de tecido foliar, aproximadamente 1 polegada quadrada em tamanho. Coloq....
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Resultados
Um resultado positivo produz uma banda distinta correspondentes a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Lss/Las6066, e/ou uma banda distinta, correspondente a 700 bp para Laa2/Laj5, inserida a β ribosomal 16S operon9. A banda de controle interno de amplificação também deve aparecer em 400 bp. Esta banda corresponde a amplificação do gene cítricas caixa 10e deve apar.......
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Discussão
É fundamental que todos os passos são seguidos exatamente para alcançar as melhores condições experimentais. Tecido de folha inteira foi usado durante esta demonstração; no entanto, o protocolo pode ser modificado para incluir teoricamente qualquer tipo de tecido de planta. Anteriormente, investigadores extraído DNA genômico de tecido de veia foliar, ao invés de tecido foliar inteira e alcançado semelhantes resultados11. Se a banda correspondente ao gene de citrinos caixa não comparecer, .......
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Divulgações
Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu e Zheng Qing Fu declaram sem conflitos de interesse.
Agradecimentos
Conceituação, H.C. e z. p. F.; Investigação, H. C., J. C e z. p. F; Recursos, z. p. F.; Escrevendo - projecto Original, I. r. P.; Escrita – revisão e edição, I. r. P., J. C., C. H., S. L. T. e z. p. F.; Visualização, H. C.; Supervisão, z. p. F.; Financiamento de aquisição, z. p. F e F. p. L.
Projeto apoiado pela Carolina do Sul melhorar professor qualidade ensino superior estado subvenção intitulado, conhecimento de processos de planta realçando médio notas ciência dos professores, estruturas e funções através do engajamento em pesquisa de Ciências de planta (planta Ciência)
Fundos premiados pelo United ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard | Promega | A1120 | Fonte de Núcleos Soluções de Lise, RNase, Precipitação de Proteínas e Reidratação de DNA |
| Nitrogênio líquido | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro com painel de controle | Microondas Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W | Centrífuga | N/A | |
| 5424 | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 banho-maria digital | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Espátula de metal | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Almofariz e pilão | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Misturador de vórtice | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Estéril 10 μ L pontas | TipOne | 1161-3730 | |
| Estéril 200 μ L pontas | TipOne | 1163-1730 | |
| Estéril 1250 μ Pontas L | TipOne | 1161-1750 | |
| Kit de pipetador de volume variável | VWR | 75788-460 | |
| Brometo de etídio | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Ácido acético | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Base Tris | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μ cubeta | Eppendorf | 6138000018 | |
| Bandeja de fundição empilhável e pentes | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Fonte de alimentação básica | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Bioespectrômetro básico | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0,2 mL Tubos de PCR | Fisher scientific | AB-0620 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Água, grau PCR | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ Escada de DNA | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
- Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic....
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Reimpressões e permissões
