특정 및 감귤 류 녹화 병원 체 Candidatus liberibacter 종 감귤 잎 조직 샘플에서 사용 하 여 기존의 PCR의 정확한 검출
Summary
감귤 류 녹화는 세계적으로 감귤 류 작물에 영향을 미치는 특히 파괴적인 질병 이다. 여기에 제시 된 간단한 방법을 사용 하는 PCR 및 감귤 잎 조직이의 게놈 DNA 추출 감귤 류 녹화 병원 체, Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 정확한 식별에 대 한
Abstract
감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 세계적으로 감귤 류 농장을 ravaging 파괴적인 감귤 류의 질병 이다. 이 질병 원인과 비대칭 노란 잎 mottling, 정 맥 yellowing, defoliation, 루트 부패, 궁극적으로, 감귤 류 식물의 죽음. 감염, 감귤 류 식물 성장 저하는 고 시즌에서 꽃을 생산. 이 꽃 거의 항복 과일, 그리고 그 작은, 쓴, 불규칙 모양의 감귤 항복 할 바람직하지 않다. 이 질병은 감염 된 감귤 직물의 접목 하 여 아시아 감귤 류 psyllid, Diaphorina citri에 의해 확산. 병원 체는 감귤 류 식물 내에서 길고 가변 인큐베이션 기간-가끔 년 전에 증상이 나타납니다. 이 병원 균에서 체 외에서 배양 하려고 낮은으로 인해 성공 했습니다 하 고 내 병원 체의 고르지 못한 농도 감귤 류 조직, 감염 또는 환경 복제 하기 어렵기 때문에 조건의 성장에 도움이 병원 체입니다. 전에 그것은, 그것의 긴 잠복기와 병원 체 문화 연구원 못하는 질병을 식별 하기 위해 매우 어렵습니다. 그 결과, 질병만 된다 명백한 후 갑자기 감귤 류의 농부의 전체 수율을 파괴. 여기에 제시 된 감귤 류 녹화 병원 체, 게놈 DNA 추출 키트 및 PCR를 사용 하 여 Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 구체적인 검색 방법이입니다. 이 메서드는 간단 하 고, 효율적, 비용 효과, 고 정량 분석에 대 한 적응. 이 메서드는 모든 감귤 류의 조직;에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 잠재적으로 조직에 병원 체의 양에 의해 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드 이전, 감염 된 감귤 류 식물을 식별 하는 감귤 류의 농민을 허용 하 고 더욱 확산 될 수 있습니다 전에이 파괴적인 질병의 확산을 억제.
Introduction
감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 감귤 나무의 상당한 손실이 발생 했습니다. 한 대표적인 케이스는 플로리다, 질병을 70% 감소를 플로리다 오렌지 박스의 생산에 244 백만 상자에서 1997-1998 시즌에 2016-2017 시즌1월 70 백만 상자 전망 이다. 플로리다에서 감귤 나무의 90% 이상 감염된2, 고 플로리다 감귤 산업 손실 약 1 십억 달러 감귤 류 녹화3중요 한 역할 담당 하는 점에서 감귤 류의 질병으로 인해 매년 추정 된다. 감귤 류 녹화 침략 적 아시아 감귤 류 psyllid Diaphorina citri 에 의해 주로 전염 됩니다 그러나 또한 감염 된 조직. 의 접목 하 여 확산 될 수 있습니다. 질병 정 맥, 비대칭 노란 잎 mottling, 조 defoliation, 나뭇가지 dieback, 루트 부패 및 식물의 죽음의 황 변 발생 합니다. 중요 한 것은, 질병 거의 과일을 생산 하는 시즌에서 꽃을 생산 하는 감귤 류 식물을 발생 합니다. 감염 된 감귤 류 식물에 의해 생산 되는 과일은 미 숙, 녹색, 및 쓴 맛4.
이 방법의 목적은 정확 하 게 하는 것입니다 하 고 정확 하 게 운동 박테리아 Candidatus liberibacter 종, 감귤 류 녹화, 감염 된 감귤 나무5의 체 관 부 내 생활의 원인이 되는 에이전트를 식별 합니다. 게놈 DNA는 살아있는 박테리아를 포함 하는 전체 잎 조직에서 추출 됩니다. 이 추출 된 게놈 DNA oligonucleotides 세균의 16S rDNA 시퀀스에 보완를이 순서를 증폭 하는 데 사용 됩니다 기존의 PCR에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다. 감귤 류의 FBOX 유전자 보완 oligonucleotides 내부 증폭 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 이전 연구6에서 성공 하려면 입증 되었습니다 때문에이 방법을 사용 하 여 선택 했습니다.
이 메서드는 간단 하 고, 상대적으로 저렴 한, 어떤 일반적으로 갖춘된 생화학 실험실에서 수행할 수 있는 명확한 이점이 있다. 또한, PCR이 병원 체7, 그리고 생존과 이내 asymptomatic 호스트8년 재현 병원 체의 능력 배양의 어려움으로 인해이 병원 체를 탐지 하기 위한 가장 정확 하 고 정확한 방법에 남아 있다. 많은 다른 전문 PCR 분석 실험 성공적으로;이 병원 체를 검출 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 기존의 PCR 무 증상 호스트8내 특히 정확 하 고 특정 검색에 대 한 간단한 분석 결과 남아 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그것은 중요 한 최적의 실험 조건 달성 하기 위해 정확 하 게 모든 단계는 따 랐 다입니다. 전체 잎 조직;이 데모 중에 사용 된 그러나, 이론적으로 식물 조직의 모든 종류를 포함 하는 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이전, 연구 전체 잎 조직, 보다는 오히려 잎 정 맥 조직이, genomic DNA를 추출 있고 비슷한 결과11를 달성. 감귤 류의 FBOX 유전자에 해당 하는 밴드를 하지 못하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H.C. 개념과 Z. Q. F.; 조사, H. C., 제이 C, 그리고 Z. Q. F; 리소스, Z. Q. F.; 쓰기-원래 초안, I. A. P.; 쓰기-검토 및 편집, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. 그리고 Z. Q. F.; 시각화, H. C.; 감독, Z. Q. F.; 자금 수집, Z. Q. F와 F. Q. l.
사우스 캐롤라이나 개선 교사 품질 등 교육 상태 부여 라는 프로젝트, 강화 중간 학년 과학 교사 ‘ 지식 공장 과정, 구조 및 기능을 통해 참여 식물 과학 연구 (공장에서 과학)
미국 Sates의 교육부 (CFDA 번호 84.367B)에 의해 수 여 하는 자금
게놈 DNA 샘플 제공에 대 한 플로리다의 대학 박사 Nian 왕 감사 하 고 싶습니다 저자에서 감염 감귤 나무 발렌시아.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
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- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
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