Spesifikk og nøyaktig påvisning av sitrus Greening patogen Candidatus liberibacter spp. bruke konvensjonelle PCR på sitrus blad vevsprøver
Summary
Sitrus Greening er en spesielt ødeleggende sykdom som påvirker sitrus avlinger globalt. Presenteres her er en enkel metode bruker PCR og genomisk DNA utvinning av sitrus blad vev for nøyaktig og presis identifikasjon av sitrus greening patogen, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Sitrus greening, også kjent som huanglongbing, er en destruktiv sitrus sykdom herjer sitrus gårder globalt. Denne sykdommen fører asymmetrisk gult blad mottling blodåre gulfarging, den høye saltholdigheten, rot forfall og til slutt død av sitrus anlegget. Når infisert, sitrus plantene har forkrøplet vekst og produsere blomster utenfor sesongen. Disse blomstene gi sjelden frukt, og de som gi små, bitter, uregelmessig formet sitrus frukt som er ikke ønskelig. Denne sykdommen spres ved den asiatisk sitrus psyllid, Diaphorina citri, og pode av infiserte sitrus vev. Patogen har en lang og variabel inkubasjonstid innen sitrus anlegget, noen ganger år, tidligere tegn komme. Forsøk på å kultur denne patogen i vitro har vært mislykket, muligens på grunn av lav og ujevn konsentrasjon av patogen innen infisert sitrus vev, eller fordi det er vanskelig å gjenskape den miljømessige forholdene til rette for vekst patogen. Det er svært vanskelig å identifisere sykdommen før den har spredt, på grunn av sin lange inkubasjonstiden og forskere manglende evne å kultur patogen. Resultatet blir sykdommen bare tydelig etter plutselig ødelegge sitrus bonde hele avkastning. Presenteres her er en metode for nøyaktig og bestemt påvisning av sitrus greening patogen, Candidatus liberibacter spp. bruker genomisk DNA utvinning kit og PCR. Denne metoden er enkel, effektiv, kostnadseffektiv og tilpasses kvantitativ analyse. Denne metoden kan tilpasses for bruk på alle sitrus vev; men er det potensielt begrenset av mengden patogen i vevet. Denne metoden vil likevel tillate sitrus bønder å identifisere infiserte sitrus planter tidligere og dempe spredningen av denne ødeleggende sykdommen før det kan videre spres.
Introduction
Sitrus greening, også kjent som huanglongbing, har forårsaket betydelig tap av sitrus trær. En representant saken er Florida, der sykdommen er forecasted for å føre en 70% reduksjon i produksjonen av Florida oransje bokser fra 244 millioner bokser i 1997-1998-sesongen å 70 millioner bokser i 2016-2017 sesong1. 90% av sitrus trær i Florida er over infisert2, og det er anslått at Florida sitrus næringen taper ca en milliard dollar hvert år på grunn av sitrus sykdommer, der sitrus greening spiller en viktig rolle3. Sitrus greening spres hovedsakelig av invasiv asiatisk sitrus psyllid Diaphorina citri, men kan også spres ved pode av infiserte vev. Sykdommen forårsaker gulfarging av årer, asymmetrisk gult blad mottling, tidlig den høye saltholdigheten, kvist dieback, rot forfall og død av anlegget. Viktigere, fører sykdommen sitrus anlegget å produsere blomster av sesongen, som sjelden produserer frukt. Frukt som produseres av infiserte sitrus planter er umoden grønne og bitre smaker4.
Formålet med denne metoden er å nøyaktig og identifisere nøyaktig motile bakterie Candidatus liberibacter spp., den utløsende agenten for sitrus greening, bor i phloem av infiserte sitrustrær5. Genomic DNA er Hentet fra hele blad vev, som inneholder live bakterier. Dette utdraget genomisk DNA brukes som mal for konvensjonelle PCR, hvor oligonucleotides utfyllende til bakteriens 16S rDNA sekvens brukes til å forsterke denne sekvensen. Oligonucleotides komplementær til en sitrus FBOX genet brukes som en intern forsterkning kontroll. Vi valgte å bruke denne metoden, fordi det har vist seg for å være vellykket i tidligere forskning6.
Denne metoden har klar fordel av å være enkel, relativt billig og kan utføres i alle normalt utstyrt biokjemi lab. I tillegg fortsatt PCR mest nøyaktig og presis metoden for å oppdage denne patogen, på grunn av vanskelighetene med dyrking denne patogen7og den patogene evne til å overleve og reprodusere i år i en asymptomatisk vert8. Mange forskjellige spesialitet PCR analyser har blitt brukt til å oppdage denne patogen; konvensjonelle PCR imidlertid enkleste analysen for nøyaktig og bestemt deteksjon, spesielt innen asymptomatisk verter8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er viktig at alle trinnene blir fulgt nøyaktig for å oppnå optimal eksperimentelle forhold. Hele blad vev ble brukt under denne demonstrasjonen; protokollen kan imidlertid endres teoretisk med alle typer anlegg vev. Tidligere har forskere Hentet genomisk DNA fra blad blodåre vev, i stedet for hele blad vev, og oppnådde lignende resultater11. Hvis bandet tilsvarer sitrus FBOX genet ikke vises, resultatet er ugyldig, og det kan være ett eller flere av flere tekniske feil i drift p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Conceptualization, H.C. og Z. Q. F.; Etterforskningen, H. C., J. C og Z. Q. F; Ressurser, Z. Q. F.; Skrive – opprinnelige utkastet, I. A. P.; Skrive-gjennomgang og redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. og Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tilsyn, Z. Q. F.; Finansiering oppkjøpet, Z. Q. F og F. Q. L.
Prosjekt støttet av en South Carolina forbedre lærer kvalitet høyere utdanning statlig bevilgning tittelen, styrke midt karakterer Science Teachers’ kunnskap av anlegget prosesser, strukturer og funksjoner gjennom engasjement i anlegget Sciences Research (anlegg Science)
Midler tildelt av United Sates Institutt for utdanning (CFDA nummer 84.367B)
Forfatterne gjerne takke Dr. Nian Wang av University of Florida for å gi genomisk DNA-prøver fra infisert Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
