Конкретные и точного обнаружения цитрусовых озеленение возбудителя Candidatus liberibacter spp. Использование обычных ПЦР на цитрусовые образцы тканей листа
Summary
Цитрусовые озеленение является особенно разрушительным заболевание, поражающее цитрусовых культур во всем мире. Представленные здесь является простой метод с помощью ПЦР и Геномную ДНК добыча цитрусовых листовой ткани для точной и достоверной идентификации возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, является разрушительной цитрусовых заболевание опустошает цитрусовых ферм во всем мире. Эта болезнь вызывает асимметричный желтый лист крапчатость, пожелтение вен, дефолиации, корневой гнили и в конечном счете, смерть цитрусовых растений. Когда зараженный, цитрусовые растения низкорослые роста и производят цветы вне сезона. Эти цветы редко дают плоды, и те, которые дают небольшие, горький, неправильной формы цитрусовых, которые не являются желательными. Эта болезнь распространяется азиатских цитрусовых psyllid, Diaphorina citri и путем прививки инфицированные ткани цитрусовых. Возбудитель имеет длинный и переменной инкубационный период в цитрусовых растений — иногда годы, прежде чем симптомы появляются. Попытки культуры этот возбудитель в vitro были безуспешными, возможно из-за низкой и неравномерным концентрация патогена в инфицированных цитрусовых ткани, или потому, что трудно повторить экологических условий благоприятствующих росту патогена. Это очень трудно определить заболевание, прежде чем он распространился, благодаря его длительный инкубационный период и неспособность исследователей культуры возбудителя. В результате болезнь только становится очевидной после внезапно уничтожить весь урожай цитрусовых фермер. Представленные здесь — это метод для точной и конкретной обнаружения возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp., с использованием геномной ДНК добыча комплект и ПЦР. Этот метод является простой, эффективной, экономически эффективным и адаптированы для количественного анализа. Этот метод может быть адаптирована для использования на любой цитрусовых ткани; Однако это потенциально ограничивается количество патогена присутствуют в ткани. Тем не менее этот метод позволит цитрусовых фермеров для выявления зараженных цитрусовых растений ранее и сдерживанию распространения этой разрушительной болезни, прежде чем она может распространяться далее.
Introduction
Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, вызвало значительные потери цитрусовых деревьев. Один представитель случай является Флорида, где, по прогнозам, болезнь вызывают снижение на 70% в производстве Флорида оранжевый коробки из 244 миллиона коробок в сезоне 1997-1998 годов до 70 миллионов коробок по состоянию на 2016-2017 сезон1. Свыше 90% цитрусовых деревьев во Флориде являются зараженные2, и предполагается, что цитрусовая промышленность Флорида теряет около одного миллиарда долларов каждый год благодаря цитрусовых заболеваний, в котором цитрусовых озеленение играет важную роль3. Цитрусовые озеленение распространяется главным образом при инвазивных азиатских цитрусовых psyllid Diaphorina citri, но может также передаваться путем прививки зараженные ткани. Болезнь вызывает пожелтение вен, асимметричные желтый лист крапчатость, преждевременный листопад, отмирание веточку, корневой гнили и смерти завода. Важно отметить, что болезнь вызывает цитрусовые растения производить цветы вне сезона, которые редко плодоносить. Плоды, которые производится инфицированных цитрусовых растений незрелых, зеленый и горький, дегустация4.
Цель этого метода является точно и точно идентифицировать подвижные бактерия Candidatus liberibacter spp., возбудителя цитрусовых озеленение, живущих в пределах флоэма зараженных цитрусовые деревья5. Геномная ДНК, извлеченные из ткани весь лист, который содержит живых бактерий. Этот геномной ДНК используется в качестве шаблона для обычных PCR, где олигонуклеотиды дополняет бактерия 16S рДНК последовательности используются для усиления этой последовательности. Олигонуклеотиды комплементарную цитрусовых Транслируется используются как элемент внутреннего усиления. Мы решили использовать этот метод, потому что было доказано, чтобы быть успешным в предыдущих исследований6.
Этот метод имеет явное преимущество простой, относительно недороги и могут быть выполнены в любой лаборатории обычно оборудованы биохимии. Кроме того ПЦР остается наиболее точное и точный метод для обнаружения этого патогена, из-за сложности культивирования Этот возбудитель7и возбудителя способность выжить и воспроизвести лет бессимптомно принимающей8. Многие различные специальности анализы ПЦР были использованы для успешного обнаружения возбудителя; Однако обычные ПЦР остается простейший assay для точной и конкретной обнаружения, особенно в рамках бессимптомной хостов8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важно, что все шаги выполняются точно для достижения оптимального экспериментальных условиях. Весь лист ткани был использован во время этой демонстрации; Однако можно изменить протокол теоретически включать любые виды растительной ткани. Ранее Исследователи извлекали геномной ДНК и?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Концептуализации, H.C. и Z. Q. ф; Расследование, H. C., J. C и Z. Q. F; Ресурсы, Z. Q. ф; Написание – оригинальный проект, I. A. P.; Написание – обзор и редактирование, I. A. P., J. C., H. C., с л. т. и з. Q. ф; Визуализация, H. C.; Надзор, Z. Q. ф; Финансирование приобретения, Z. Q. F и F. Q. л
Проект поддержан Южная Каролина улучшение учитель качества высшего образования государственный грант под названием, повышение среднего классов науки учителя знания растений процессов, структур и функций посредством участия в наук исследования растений (завод Наука)
Фонды, награжден Соединенные Штатов Департамента образования (CFDA номер 84.367B)
Авторы хотели бы поблагодарить Nian Ванг из университета Флориды для предоставления геномной ДНК образцов от инфицированных Citrus sinensis Валенсии.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
