Specifika och korrekt upptäckt av den Citrus grönare patogen Candidatus liberibacter spp. med konventionella PCR på Citrus Leaf vävnadsprover
Summary
Citrus grönare är en särskilt destruktiv sjukdom som påverkar citrus grödor globalt. Presenteras här är en enkel metod med hjälp av PCR och genomisk DNA-extraktion av citrus bladvävnad för korrekt och exakt identifiering av citrus grönare patogener, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Citrus grönare, även känd som huanglongbing, är en destruktiv citrus sjukdom härjar citrus gårdar globalt. Denna sjukdom orsakar asymmetriska gult löv fläckar, ven gulfärgning, kronutglesning, roten förfall och slutligen döden av en citrus växt. När smittade, citrusväxter har hämmad tillväxt och producerar blommor utanför säsongen. Dessa blommor ge sällan frukt, och de som ger små, bitter, oregelbundet formade citrusfrukter som är inte önskvärt. Sjukdomen sprids genom den asiatiska citrus psyllid, Diaphorina citri, och genom ympning av infekterade citrus vävnad. Patogenen har en lång och varierande inkubationstid på citrus anläggningen — ibland år, framför symtom framträda. Försök att kultur denna patogen i vitro har misslyckats, möjligen på grund av låga och ojämn koncentration av patogenen inom infekterade citrus vävnad, eller eftersom det är svårt att replikera den miljömässiga förutsättningar för tillväxt av patogenen. Det är mycket svårt att identifiera sjukdomen innan det har spridit sig, på grund av dess lång inkubationstid och forskarnas oförmåga att kultur patogenen. Som ett resultat, blir sjukdomen bara uppenbara efter plötsligt förstör en citrus bondens hela avkastningen. Presenteras här är en metod för den korrekta och specifikt påvisande av citrus grönare patogener, Candidatus liberibacter spp. med en genomisk DNA extraktion kit och PCR. Denna metod är enkel, effektiv, kostnadseffektiv och anpassningsbar för kvantitativ analys. Denna metod kan anpassas för användning på någon citrus vävnad; Det är dock potentiellt begränsas av mängden patogener närvarande i vävnaden. Denna metod kommer dock tillåta citrus jordbrukare att identifiera smittade citrusväxter tidigare och stävja spridningen av denna destruktiva sjukdom innan det kan ytterligare spridning.
Introduction
Citrus grönare, även känd som huanglongbing, har orsakat en betydande förlust av citrusträd. Ett representativt fall är Florida, där sjukdomen förutspås orsaka en 70% minskning i produktionen av Florida orange lådor från 244 miljoner lådor under säsongen 1997-1998 till 70 miljoner lådor per den 2016-2017 säsong1. 90% av citrusträd i Florida är över infekterade2, och det uppskattas att Florida citrus industrin förlorar ungefär en miljard dollar varje år på grund av citrus sjukdomar, vari citrus grönare spelar en viktig roll3. Citrus grönare sprids främst genom den invasiva asiatiska citrus psyllid Diaphorina citri, men kan också spridas genom ympning av infekterad vävnad. Sjukdomen orsakar gulfärgning av vener, asymmetriska gult löv fläckar, tidig avlövning, twig ramorum, roten förfall och död av anläggningen. Ännu viktigare, orsakar sjukdomen citrus anläggningen att producera blommor utanför säsongen, som sällan ger frukt. Frukt som produceras av infekterade citrusväxter är omogna, gröna och bitter smak4.
Syftet med denna metod är att noggrant och identifiera exakt de motila bakterien Candidatus liberibacter spp., vilka smittämnen av citrus grönare, bor inom phloemen av infekterade citrusträd5. Genomiskt DNA extraheras från hela bladvävnad, som innehåller levande bakterier. Denna extraherade genomiskt DNA används som mall för konventionella PCR, där oligonukleotider komplement till bakteriens 16S rDNA sekvens används för att förstärka denna sekvens. Oligonukleotider komplement till en citrus FBOX -gen används som en inre förstärkning kontroll. Vi valde att använda denna metod, eftersom det har visat sig vara framgångsrika i tidigare forskning6.
Denna metod har tydligt fördelen att vara enkel, relativt billig och kunna utföras i någon normalt utrustade biokemi lab. Dessutom förblir PCR metoden mest exakta och precisa för att upptäcka denna patogen, på grund av svårigheten att odla denna patogen7och patogens förmåga att överleva och reproducera år inom en asymtomatisk värd8. Många olika specialitet PCR-analyser har använts för att identifiera denna patogen; konventionella PCR är dock fortfarande den enklaste test för korrekt och specifikt påvisande, särskilt inom asymtomatiska värdar8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är viktigt att alla åtgärder följs exakt för att uppnå optimal försöksbetingelser. Hela bladvävnad användes under denna demonstration; protokollet kan dock ändras för att teoretiskt innehålla typ av växtvävnad. Forskare har tidigare utvunnits genomiskt DNA från ven bladvävnad, snarare än hela bladvävnad och uppnådde liknande resultat11. Om bandet motsvarar citrus FBOX genen inte infinner sig, resultatet är ogiltig, och det kan finnas en eller flera av flera teknis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Konceptualisering, H.C. och Z. Q. F.; Utredning, H. C., J. C och Z. Q. F; Resurser, Z. Q. F.; Skriva – ursprungliga utkastet, I. A. P.; Skrivande – recension & redigering, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. och Z. Q. F.; Visualisering, H. C.; Tillsyn, Z. Q. F.; Finansiera förvärv, Z. Q. F och F. f. L.
Projekt som stöds av en South Carolina förbättra lärare kvalitet högre utbildning statsbidrag med titeln, förbättra mellersta kvaliteter vetenskap lärarnas kunskap av växt processer, strukturer och funktioner genom engagemang i Plant Sciences Research (växt Vetenskap)
Medel som tilldelas av Förenta staterna utbildningsdepartementet (CFDA nummer 84.367B)
Författarna vill tacka Dr Nian Wang av University of Florida för att tillhandahålla genomisk DNA-prover från infekterade Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
Referências
- Field Office, F. l. o. r. i. d. a. . Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. . The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , (2012).
- UICEP. . Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. . Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
