Hög genomströmning identifiering av synergistisk läkemedelskombinationer med överlappning2 Metod
Summary
Synergistisk läkemedelskombinationer är svårt och tidskrävande att identifiera empiriskt. Här, beskriver vi en metod för att identifiera och validera synergistisk små molekyler.
Abstract
Även om antimikrobiella läkemedel har ökat dramatiskt den livslängd och livskvalitet i de 20– talet, hotar antimikrobiell resistens vår hela samhällets förmåga att behandla systemiska infektioner. I USA ensam döda antibiotikaresistenta infektioner cirka 23.000 personer per år och kostnaden cirka 20 miljarder dollar i ytterligare vård. En strategi för att bekämpa antimikrobiell resistens är kombinationsterapi, vilket är särskilt användbart i det kritiska tidiga skedet av infektionen, innan den infekterande organismen och dess drog resistens profil har identifierats. Många antimikrobiella behandlingar använder kombinationsbehandlingar. Men de flesta av dessa kombinationer är additiva, vilket innebär att den kombinerade effekten är detsamma som summan av de enskilda antibiotisk effekten. Vissa kombinationsbehandlingar är synergistiska: kombinerade effekten är mycket större än additiv. Synergistiska kombinationer är särskilt användbara eftersom de kan hämma tillväxten av antimikrobiella läkemedel resistenta stammar. Dessa kombinationer är dock sällsynta och svåra att identifiera. Detta beror på det stora antalet molekyler som behövs för att testas i ett parvisa sätt: ett bibliotek av 1000 molekyler har 1 miljon potentiella kombinationer. Således har ansträngningar gjorts att förutsäga molekyler för synergy. Denna artikel beskriver vår hög genomströmning metod för att förutsäga synergistisk småmolekylära par kallas den överlappning2 Metod (O2M). O2M använder mönster från kemikalie-genetiska datamängder för att identifiera mutanter som är överkänsliga för varje molekyl i en synergistisk par men inte till andra molekyler. Brun labbet utnyttjar denna tillväxt skillnad genom att utföra en hög genomströmning skärm för molekyler som hämmar tillväxten av mutant men inte vildtyps-celler. Labbets arbete tidigare identifierat molekyler som samverka med den antibiotika trimetoprim och den svampdödande läkemedel flukonazol använda denna strategi. Här presenterar författarna en metod till skärmen för nya synergistiska kombinationer, som kan ändras för flera mikroorganismer.
Introduction
Antibiotikaresistenta bakterier orsakar mer än 2 miljoner infektioner och 23.000 dödsfall årligen i USA enligt CDC1. Nya behandlingar behövs för att övervinna dessa infektioner. Strategier för att identifiera dessa nya behandlingar inkluderar utvecklingen av nya antimikrobiella läkemedel eller återanvända små molekyler som godkänts för andra villkor för att behandla mikrobiella infektioner2,3,4. Ny läkemedelsutveckling är dock mycket kostsamma och tidskrävande. Återanvända droger kan inte identifiera nya läkemedel eller drog mål5,6. Vårt lab fokuserar på en tredje strategi kallas synergistisk kombination terapier. Synergistiska kombinationer uppstå när två små molekyler tillsammans har en effekt som är större än den additiv effekten av deras individuella efficacies7. Dessutom, kan synergistiska kombinationer vara effektiv mot en patogen som är resistent mot en av de små molekylerna i paret förutom att ha mindre oönskade off-target effekter, rendering dem stora potentiella8,9, 10.
Synergistisk par är sällsynta, förekommer hos cirka 4-10% av drogen kombinationer11,12,13. Således, traditionella tekniker såsom parvisa skärmar är utmanande och tidskrävande, med tusentals potentiella kombinationer från ett litet bibliotek av hundra molekyler. Dessutom synergistiska interaktioner vanligen kan inte förutsägas från aktiviteten av föreningar14. Men utvecklat författarna en hög genomströmning till skärmen för synergistisk par, kallas den överlappning2 Metod (O2M)12. Denna metod, som beskrivs här, möjliggör snabbare, effektivare identifiering av dessa synergistiska kombinationer. O2M kräver användning av en känd synergistisk par och en kemisk-genetik-datamängd. Kemisk-genetik datamängder genereras när ett bibliotek av knockout mutanter odlas i närvaro av många olika små molekyler. Om en molekyl i en känd synergistisk par inducerar den samma fenotypen från en viss knockout mutant som andra synergistiska molekylen, bör någon annan liten molekyl som framkallar fenotypen från det samma mutant också samverka med varje medlem av kända synergistisk par. Detta resonemang har använts i brun lab för att identifiera synergistisk antibiotika par aktiva mot Escherichia coli (E. coli) och synergistisk svampdödande läkemedel par aktiva mot patogena svampen Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M är inte bara anpassningsbar för olika patogener, men tillåter för screening av stora bibliotek av molekyler att identifiera synergistisk par snabbt och enkelt. Screening med genetiska mutant identifieras av O2M tillåter oss att validera bara dessa små molekyler som förutspås för synergy. Således, testa en 2.000-molekyl bibliotek pairwise skulle ta månader, om det fanns endast 20 molekyler i det biblioteket som förutspådde för att samverka, testning för synergy nu tar några dagar. O2M kräver inte programmeringskunskaper och utrustningen som behövs finns i de flesta labs eller corefaciliteter. Utöver forskare intresserade av läkemedelskombinationer är O2M analys av intresse för någon som har avslutat en drog skärm och vill expandera sina hits genom att identifiera viktiga läkemedelsinteraktioner. Nedan finns protokollet för att identifiera synergistisk små molekyler i bakterier, samt validera de förutspådda synergistiska interaktioner i välkända analyser15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Synergistisk småmolekylära par kan vara ett kraftfullt verktyg för att behandla mikrobiella infektioner, men de har inte nått sin full klinisk potential eftersom synergistisk par är utmanande att identifiera. Detta dokument beskriver en metod för att identifiera synergistisk par mycket snabbare än enkla parvisa kombinationer. Genom att använda kemisk-genetik datamängder, identifierar O2M mutanter med gen knockouts som kan sedan användas som en avläsning till skärmen stora bibliotek med små molekyler för att…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av en start bidrag från Institutionen för patologi, University of Utah till J.C.S.B.
Materials
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -. Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
