本文提供了一种从致心律失常心肌病患者心内膜心肌活检样品中分离心间质基质细胞的方法。描述了它们的表征和提高脂肪分化的协议。
正常的成人心脏由几种不同的细胞类型组成, 其中心间质基质细胞代表丰富的人群。这些细胞的分离提供了研究其参与心脏疾病的可能性, 此外, 还提供了一个有用的主要细胞模型来调查生物机制。
本文介绍了从致心律失常心肌病患者活检标本中分离 C MSC 的方法。心内膜心肌活检抽样是引导在右心室区域附近的疤痕可视化的电解剖制图。本文介绍了胶原酶活检的消化及其在培养基中的塑料碟上的电镀, 以允许 C MSC 的生长。分离的细胞可以被扩展在文化中为几个段落。为证实其间充质表型, 提供了免疫表型鉴定的描述。c-msc 能够区分成几个细胞类型, 如脂肪、软骨细胞和成骨细胞: 在脂肪的背景下, 以患者心脏脂肪细胞沉积为特征, c-msc 的分化和介绍了脂滴积累的表征。
间充质基质细胞 (MSC) 是成人细胞, 在许多组织中具有重要的支持作用1。骨髓代表了 MSC 的历史来源, 但它们可以从不同的组织, 包括胎盘, 脂肪组织, 脐血, 肝脏和心脏1,2分离。
在 2006年, 国际细胞治疗学会 (ISCT) 第一次指定了定义人类 MSC3的最低标准。特别是, MSC 必须有能力坚持塑料。它们表达特定的表面抗原: CD44、CD105、CD29 和 CD90 间充质标志物的阳性, 以及 CD14、CD45、CD34、CD31 造血和内皮标记的阴性。由于 HLA-DR 缺乏表达, MSC 无法触发 alloreactivity。此外, 它们是有潜力分化为脂肪、软骨细胞和成骨细胞血统的有能力的干细胞1,3。
心脏间充质基质细胞 (C MSC) 集中于心脏细胞组成, 在正常的成人心脏4,5中是丰富的。它们在正常的心脏功能和病理状况中起着关键作用。生理学上, C-MSC 提供了一种微环境, 支持心肌的结构和功能完整性, 在心脏疾病中, 它们被激活, 以响应心脏损伤参与伤口愈合和纤维化重塑6 ,7。
最近, 致心律失常心肌病 (ACM) 脂肪替代的 C MSC 的参与已被证明为8。特别是, ACM 是一种遗传紊乱, 主要是由于 desmosomal 基因突变导致心肌纤维-脂肪替代, 主要在右心室9。这种替代, 从心外膜延伸到心内膜, 创造了一个非传导性基质, 引起渐进性心力衰竭和恶化室性心律失常, 这可能导致, 在严重的情况下, 突然死亡。Sommariva et 。证实了说明心脏切片前脂肪细胞存在的间充质来源。此外, 从心内膜心肌活检中分离出的 C-MSC 表达 desmosomal 基因, 因此可能受其突变的影响。特别是, 在脂肪条件下, 其比控制心脏的脂肪积累更多的脂质。这一证据得出结论, C-MSC 在疾病发病机制中都有积极作用, 并代表了一个有效的细胞模型来研究。
为便于今后在这方面的研究或其他心脏活检的心脏病, 提出了一个详细的协议, 以隔离心内膜心肌组织的小片段, 他们的扩张, 他们的免疫表型鉴定表征和脂肪分化。
msc 和 C-msc:MSC 是居住在不同成体组织的基质含量的能细胞, 如骨髓, 脂肪组织, 软骨, 脑, 皮肤, 胎儿附件和心脏12。在基本和平移研究12、13中, 已经进行了不同的研究来分离和描述它们的潜在应用。
在健康的情况下, MSC 是静止的, 自我更新的低速率14。由于它们受到环境病理变化的影响, 它们通过直接转分化、基质沉积或分泌效应14来反应促进组织重塑。
心脏理学硕士 (C msc) 代表心脏4的一个大的非心肌细胞的人口。它们起源于心外膜, 并迁移到接受上皮间充质过渡过程的心肌中15。它们通过与心肌细胞和细胞外基质稳态的相互作用7,16, 在生理和病理状态下促进心脏结构的机械和电学完整性。然而, 广泛的 C MSC 函数仍未完全理解。在其分离后进行的体外研究可以促进对它们在生理和病理条件下的作用的更深认识。
从人类心脏的不同区域获得了 C MSC, 如心房附属物2,17和右心室18。
最近, 从人体右心室心内膜心肌活检样本中提取的 C-MSC 已经获得了 8, 表明源组织可能只有3-5 毫克.
可能的应用程序:本手稿中概述的方法允许获得少量简单通道的细胞, 如从非常小的心脏标本中消化和选择塑料附着。
C MSC 可以被认为是细胞模型, 因为它们易于放大和维持体外, 并且能够分化成间充质谱系 (内皮、骨和脂肪细胞)。此外, 从患者直接获得细胞的可能性构成了一个伟大的体外工具, 用于机械研究的背景下的个性化/精确医学。事实上, 这些细胞携带的基因背景和最终的特定突变的捐赠者, 并受特定的病人的特点, 如临床条件, 年龄, 性别, 生活方式和药物。此外, 对不同标记进行排序的可能性可能允许对特定的 C MSC 子集19进行研究。
众所周知, 理学硕士是不同心血管疾病的活跃参与者, 主要表现为心脏的不良重塑。因此, 它们代表了用于对抗心脏病的新治疗策略的候选目标8,20。
茎样性质及其缺乏显著的免疫原性表明了它们在心脏再生医学细胞治疗中的潜在应用。的确, 像骨髓或其他来源的 msc 一样, C-msc 可能在自体和同种异体环境中使用, 而不需要在捐助者和收件人21之间进行匹配。
此外, 从心脏组织直接分离的 C-MSC 具有由心脏微环境和表观遗传特征预处理的优点。在心脏再生医学方面, 这可能是特别重要的获得成功的结果。
到目前为止, 再生医学的前期研究发现了有用的治疗潜力在 C MSC 和他们的分泌活动18,22,23。重要的是, 临床试验中的细胞源是心脏正在进行的 cardiosfere 衍生细胞或与亚群的 C MSC13,24,25。然而, 对于骨髓衍生的 MSC, 可能需要不同的协议, 以获得临床等级 C msc26。
在 ACM 中的 C MSC:本协议主要适用于心内膜活检的病理学研究。为诊断目的, 活检的病人接受了27的治疗程序。他们的心肌逐渐被疤痕组织取代, 这是由脂肪细胞和纤维化组成的电子惰性组织。为了指导活检取样到疤痕区, 其中诊断产量最大, 心内膜心肌映射使用 10, 28, 29.本协议中使用的样本是在患病心肌的边界区。
Sommariva et . 最近定义了 c msc 在 acm 的发病机制8中的关键作用, 表明 c-msc 是在成脂心脏的活跃参与者, 因为前脂肪细胞在那些心脏是间充质来源。此外, 与本协议隔离的 C MSC 患者的活检显示, 脂肪积累和成脂的倾向比对照组多。因此, 这些细胞可以被用来确认一些分子机制的 ACM, 证明它们适合作为细胞模型的机械研究9。
限制和关键步骤:尽管直接从患者那里获得 C MSC 的好处 (见 “可能的应用” 一节), 本议定书受到不同的限制。
首先, 心脏活检程序是侵入性的, 并且经常避免, 如果不是严密地必要的。事实上, 取样心脏组织在伦理上和技术上都是有问题的。进行心脏活检的原因可能是在心肌的鉴别诊断, 监测心脏移植的状态, 或确定心脏肿瘤的存在的情况下明确诊断30。因此, 只有以协商一致声明表示为心内膜心肌活检的患者才可以注册为 C MSC 的研究.( 31)。此外, 心脏活检程序可能有临床并发症, 尤其是在型心肌病心脏。因此, electrophysiologist 的抽样总是谨慎的, 活检样本可能非常小, 危及细胞的隔离。未来的实验可以通过调整胶原酶浓度或消化时间来克服这个问题。
作为所有主要的人类细胞, C MSC 在所有表型的不同学科中表现出很高的变异性。事实上, 来自不同学科的细胞不仅在基因上是不同的, 而且还受到环境变化的制约。具体地说, 在这个实验中, 观察到细胞分离、生长和脂肪分化的高变异性。
必须承认本议定书的关键步骤。如果活检样品包括毛细血管, 它们必须被移除, 以避免内皮细胞的平行隔离, 这可能会污染 C MSC 的文化, 并且可以通过对血管的分析 (阳性 CD31) 来证明。为了获得有效的脂肪分化, 细胞必须处于活跃的生长阶段。汇流的程度也会影响脂质的积累。
方法的意义:对于以往的间充质基质细胞的分离方法, 本文首次提出了直接从人心室活检样品中提取 C MSC 的描述。尽管这一方法被建议用于治疗医用的样本, 它可能适用于所有的病人, 其中心脏活检表明。
该协议代表了以前的方法的有用的实现, 这些细胞需要更大的心脏样本32, 这往往很难收集。
此外, 样本来源也构成了一个有趣的创新。虽然心室活检通常在隔膜33上进行, 但本协议考虑了从右心室游离壁获得的样本。来自病右心室区的细胞可能更能代表 RV 疾病的病理状态。
此外, 本协议中使用的某些试剂与其他 C MSC 隔离和分化方法32不同。例如, 在本手稿中提出的胶原酶的类型是一个混合的 I 类和 II 类胶原酶与蛋白水解活动的平衡比例。此外, 消化液由溶于同一基底培养基 (IMDM) 的胶原酶混合物组成, 用于制备 C-msc 培养基, 使分离的 c msc 适应未来的生长条件。
此外, 虽然排序程序可以标准化的细胞批次, 使用全 C MSC 人口, 仅通过这些细胞的塑性黏附性质隔离, 构成简化, 而不改变免疫表型C-MSC 的特点。本文提出的 ADIPO 的组成能够导致脂肪分化, 避免其他成分如胰岛素引起的代谢失调。
此外, 该方法的脂积累量化, 这是基于对破产评估的比色强度, 提供了更多的信息关于累积脂质的数量, 如果比较的方法仅基于百分比对破产的染色阳性的细胞。通常, 通过提取与异丙醇细胞结合的破产组织, 测量其吸光度, 就能量化脂质积累。然而, 这种方法需要更多的通道, 并因异丙醇蒸发而受到变异。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由意大利卫生部、Ricerca Corrente Cardiologico Monzino IRCCS 中心提供资金。
IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
ImageJ (image processing program) | NIH | ||
Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |