I denne artikel findes en metode til at isolere hjerte mesenchymale stromale celler fra endomyocardial bioptic prøver af arrhythmogenic kardiomyopati patienter. Deres karakterisering og protokollen til at øge deres adipogenic differentiering er beskrevet.
En normal voksen hjerte er sammensat af flere forskellige celletyper, blandt hvilke hjerte mesenchymale stromale celler repræsentere en rigelige befolkning. Isolationen af disse celler giver mulighed for at studere deres inddragelse i hjerte sygdomme, og desuden giver en nyttig primære celle model for at undersøge biologiske mekanismer.
Her, er metoden til dyrkning af C-MSC fra arrhythmogenic kardiomyopati patienternes bioptic prøver beskrevet. Endomyocardial biopsi prøveudtagning er styret i områderne højre ventrikel ved siden af arret visualiseret ved electro-anatomiske kortlægning. Fordøjelsen af biopsier i collagenase og deres plating på en plastik skål dyrkningsmedium tillade C-MSC vækst er beskrevet. De isolerede celler kan udvides i kultur for flere passager. For at bekræfte deres mesenchymale fænotype, er beskrivelsen af immuno-phenotypical karakterisering fastsat. C-MSC er i stand til at differentiere i flere celletyper som adipocytter, chondrocytter og osteoblaster: i forbindelse med ACM, karakteriseret ved adipocyt indskud i patienternes hjerter, protokollerne for adipogenic differentiering af C-MSC og den karakterisering af lipid droplet ophobning er beskrevet.
Mesenchymale stromale celler (MSC) er voksne celler med en vigtig støttende funktion i mange væv1. Knoglemarven repræsenterer den historiske kilde til MSC, men de kan isoleres fra forskellige væv, herunder moderkagen, fedtvæv, navlestrengsblod, leveren og hjertet1,2.
I 2006 angivet International Society for cellulære terapi (ISCT) for første gang, de minimale kriterier for at definere menneskelige MSC3. Især skal MSC have evnen til at overholde plast. De udtrykker specifikke overflade antigener: positivitet for CD44, CD105, CD29 og CD90 mesenchymale markører, og negativitet til CD14, CD45, CD34, CD31 hæmatopoietisk og endotel markører karakterisere MSC. På grund af den manglende udtryk for HLA-DR, MSC er ude af stand til at udløse alloreactivity. Derudover er de Multipotente celler med potentiale til at differentiere mod adipogenic, Chondrocyt og osteoblastdannelse lineages1,3.
Med fokus på hjerte cellulære sammensætning, er cardiac mesenchymale stromale celler (C-MSC) rigelige i en normal voksen hjerte4,5. De spiller en afgørende rolle både i normal hjertefunktion og patologiske betingelser. Stykke tid, fysiologisk, C-MSC giver en mikromiljø, der understøtter den strukturelle og funktionelle integritet i myokardiet, i hjertesygdomme de aktiveres som reaktion på hjerte skade deltager i sårheling og fibrotisk remodeling6 ,7.
For nylig, inddragelse af C-MSC i arrhythmogenic kardiomyopati (ACM) adipøst substitution har været demonstreret8. Især er ACM en genetisk sygdom hovedsageligt forårsaget af mutationer i desmosomal gener, der fører til Myokardie fibro-fede udskiftning, hovedsagelig i højre hjertekammer9. Denne substitution, strækker sig fra epicardium til endokardiet, opretter en ikke-ledende underlag, der fremkalder progressive hjertesvigt og forværres ventrikulære arytmier, hvilket kan føre, i svære tilfælde, til pludselig død. Sommariva et al. demonstreret mesenchymale oprindelsen af de pre adipocytter stede i ACM patienternes eksplanterede hjerte sektioner. Desuden C-MSC isoleret fra endomyocardial biopsier af ACM hjerter udtrykkelige desmosomal gener og derfor kan blive påvirket af deres mutationer. Især på adipogenic betingelser, ACM C-MSC ophobes mere lipider end dem fra kontrol hjerter. Dette beviser fører til den konklusion, at C-MSC både har en aktiv rolle i sygdom patogenese og repræsenterer en gyldig celle model til at studere ACM.
For at lette fremtidig forskning i denne sammenhæng eller i andre hjertesygdomme, som et hjerte biopsi er indiceret, præsenteres en detaljeret protokol for dyrkning af C-MSC fra små fragmenter af endomyocardial væv, deres ekspansion, deres immuno-phenotypical karakterisering og adipogenic differentiering.
MSC og C-MSC: MSC er Multipotente celler bosiddende i de stromale brøkdel af forskellige voksen væv, såsom knoglemarv, fedtvæv, brusk, hjerne, hud, føtal bilagene og hjertet12. Forskellige undersøgelser har været udført for at isolere og karakteriserer dem for potentielle anvendelser i grundlæggende og Translationel forskning12,13.
I sund betingelser, MSC er inaktiv, selvstændig fornyelse på lave priser14. Da de er udsat for miljømæssige patologiske ændringer, reagerer de fremme væv remodellering gennem direkte transdifferentiation, matrix deposition eller paracrine virkning14.
Den kardiale MSC (C-MSC) repræsenterer en stor ikke-myocyte celle population af hjertet4. De stammer fra epicardium og overflytte i myokardiet gennemgår processen med epitelial til mesenchymale overgang15. De bidrager til den mekaniske og elektriske integritet af hjertets struktur, både i fysiologiske og patologiske stater, gennem interaktioner med cardiomyocytes og ekstracellulære matrix homøostase7,16. Men de brede vifte af C-MSC funktioner er stadig ikke helt forstået. Et dybere kendskab til deres rolle, både i fysiologiske og patologiske betingelser kan lettes ved in vitro- undersøgelser udført efter deres isolation.
C-MSC er opnået fra forskellige distrikter af det menneskelige hjerte, som atrial vedhæng2,17 og højre hjertekammer18.
For nylig, C-MSC fra menneskelige højre ventrikel endomyocardial bioptic prøver har opnået8, at kilde-væv kan være så lidt som 3-5 mg.
Mulige anvendelser: Metoden beskrevet i dette håndskrift giver mulighed for at opnå celler med få simple passager, som fordøjelse og udvalg for overholdelse af plast, fra meget små hjerte prøver.
C-MSC kan betragtes en celle model, da de er nemme at forstærke og vedligeholde i in vitro, og er i stand til at differentiere sig til celler af mesenchymale lineage (endotel, osteocytes og adipocytter). Desuden udgør muligheden for at opnå celler direkte fra patienter en stor in vitro- værktøj til Mekanistiske undersøgelser i forbindelse med personlig/præcision medicin. Ja, disse celler bære den genetiske baggrund og til sidst specifikke mutationer af donorerne, og er påvirket af den specifikke patienters karakteristika, som kliniske tilstande, alder, køn, livsstil og medicin. Desuden kan mulighed for at sortere dem for forskellige markører tillade undersøgelse af specifikke C-MSC delmængder19.
C-MSC er kendt for at være aktive spillere i forskellige hjerte-kar-sygdomme, for det meste karakteriseret ved negative remodellering af hjertet. De repræsenterer derfor kandidat mål for nye terapeutiske strategier til at modvirke hjertesygdomme8,20.
C-MSC stilk-lignende egenskaber og deres mangel på betydelig immunogenicitet antyder deres potentielle anvendelse i celleterapi for kardiale regenerativ medicin. Faktisk, ligesom MSC fra knoglemarven eller andre kilder, C-MSC kunne potentielt anvendes både autolog og allogen indstillinger, uden behov for matchning mellem donor og recipient21.
Desuden har C-MSC, isoleret direkte fra hjertet væv, fordelen at være klargjort af hjerte mikro-miljø og epigenetiske profil. I forbindelse med hjertets regenerativ medicin, kunne dette være særlig vigtigt at opnå vellykkede resultater.
Til dato har identificeret prækliniske undersøgelser af regenerativ medicin nyttigt terapeutiske potentiale i C-MSC og deres paracrine aktivitet18,22,23. Vigtigere, er kliniske forsøg, hvor cellen kilde er hjertet undervejs med cardiosfere-afledte celler eller delpopulationer af C-MSC13,24,25. Med hensyn til knogle-marv-afledte MSC, kan det være nødvendigt at få kliniske grade C-MSC26med forskellige protokoller.
C-MSC i ACM: Præsenteres protokollen er mest egnet til undersøgelse af patologier som en endokardial biopsi er indiceret. ACM patienter undergår bioptic procedurer til diagnosticeringsformål27. Deres myokardiet er gradvist erstattet med arvæv, en elektrisk inert væv består af adipocytter og fibrose. For at vejlede bioptic prøveudtagning til området ar, hvor det diagnostiske udbytte er maksimal, er endomyocardial mapping brugt10,28,29. De prøver, der indgår i denne protokol er taget i grænseområdet af syge myokardiet.
Sommariva et al. har for nylig defineret en central rolle i C-MSC i patogenesen af ACM8, viser, at C-MSC aktive spillere i ACM hjertet adipogenesis, da preadipocytes i disse hjerter er af mesenchymale oprindelse. Desuden isoleret C-MSC med den nuværende protokol fra ACM patienternes biopsier viste flere tilbøjelighed til både lipid ophobning og adipogenesis end kontrol. Derfor, kan disse celler bruges til at bekræfte nogle af de molekylære mekanismer af ACM, bevise deres egnethed som celle model for Mekanistiske undersøgelser9.
Begrænsninger, og kritiske trin: Trods fordelene ved at opnå C-MSC direkte fra patienter (Se afsnittet “Mulige applikationer”), er denne protokol underkastes forskellige begrænsninger.
Først og fremmest den kardiale bioptic procedure er invasiv og ofte undgås hvis ikke strengt nødvendigt. Faktisk, prøveudtagning hjerte væv er både etisk og teknisk problematisk. Grunde til at udføre en hjerte biopsi kan være opnåelse af en konkret diagnose i forbindelse med cardiomyopatier differential diagnosticering, overvågning af status for kardiale transplantationer, eller fastslå tilstedeværelsen af et hjerte tumor30. Derfor kan kun patienter som en endomyocardial biopsi er indiceret ved konsensus erklæring31 være tilmeldt til forskning på C-MSC. Desuden kan den kardiale bioptic procedure har kliniske komplikationer, først og fremmest i cardiomyopathic hjerter. Derfor electrophysiologist’s prøveudtagninger er altid forsigtige og bioptic prøver kan være meget små, gå på kompromis med isolering af celler. Fremtidige eksperimenter kunne overvinde dette problem af tuning collagenase koncentration eller timing af fordøjelsen.
C-MSC, viser som alle primære menneskelige celler, en stor variation blandt forskellige emner i alle fænotyper. Celler fra forskellige fag er faktisk ikke kun genetisk forskellige, men også underkastet variable miljømæssige konditionering. Specifikt, inden for dette eksperiment, er en høj variabilitet i isolation, vækst og adipogenic Celledifferentiering observeret.
Kritiske trin i denne protokol skal anerkendes. Hvis bioptic prøven indeholder kapillærer, skal de fjernes for at undgå den parallelle isolation i endothelial celler, som kan forurene C-MSC kultur, og kan dokumenteres ved FACS-analyse (positivitet for CD31). For at opnå en effektiv adipogenic differentiering, skal celler være i en aktiv vækstfase. Graden af sammenløbet kan også påvirke lipid ophobning.
Betydningen af metoden: Forhold til tidligere metoder til isolering af mesenchymale stromale celler er dette første gang hvor beskrivelsen af C-MSC byggetilladelse direkte fra menneskelige ventrikulær bioptic prøver foreslås det i detaljer. Selvom denne metode er foreslået til behandling af ACM patientprøver, er det potentielt gælder for alle patienter som en hjerte biopsi er indiceret.
Denne protokol udgør en nyttig gennemførelsen af tidligere metoder til opnåelse af celler, der kræves større hjerte prøver32, der ofte er vanskeligt at indsamle.
Derudover udgør eksempelkilden en interessant nyhed. Mens den ventrikulære biopsi udføres normalt på septum33, tager denne protokol konto prøver fra højre ventrikel gratis væggen. Celler, der stammer fra bydelen syge højre ventrikel kan være mere repræsentativ for den patologiske status for sygdomme der involverer RV.
Desuden, er nogle af de reagenser, der anvendes i denne protokol forskellige med hensyn til anden Christensen-MSC-isolation og differentiering metoder-32. For eksempel, type af collagenase foreslået i dette håndskrift er en blanding af klasse I og klasse II collagenases med et afbalanceret forhold af proteolytiske aktiviteter. Derudover er fordøjelsen løsning sammensat af collagenase mix opløst i samme basal medium (IMDM) anvendes til fremstilling af C-MSC næringssubstrat, så isolerede C-MSC til at tilpasse sig fremtidige vækstbetingelser.
Derudover om sortering procedurer kunne standardisere celle parti, ved hjælp af befolkningens hele C-MSC isoleret kun via egenskaben plast overholdelse af disse celler, udgør en forenkling uden at ændre immunophenotypic Karakteristik af C-MSC. Sammensætningen af T. ADIPO, der foreslås i dette håndskrift er i stand til at føre til adipogenic differentiering, undgå den metaboliske dysregulering induceret af andre komponenter såsom insulin.
Desuden, den foreslåede metode af lipid ophobning kvantificering, som er baseret på en evaluering af de ORO kolorimetriske intensitet, indeholder flere oplysninger om mængden af de akkumulerede lipider, hvis sammenlignet med metoder baseret kun på procentdelen af celler positivt at de ORO farvning. Ofte lipid ophobning er kvantificeret ved at udtrække ORO indarbejdet af celler med isopropanol og måle sin absorbans. Men denne metode kræver flere passager og udsættes for en variation på grund af isopropanol fordampning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af italienske sundhedsministerium, Ricerca Corrente til Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
ImageJ (image processing program) | NIH | ||
Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |