Summary
במאמר זה, שיטה לבודד תאי סטרומה mesenchymal לב מדגימות bioptic endomyocardial של arrhythmogenic של שריר הלב חולים מסופק. אפיון שלהם ואת פרוטוקול כדי להגביר את הבידול adipogenic שלהם מתוארים.
Abstract
לב למבוגרים נורמליים מורכב של מספר סוגי תאים שונים, וביניהם תאי סטרומה mesenchymal לב המייצגים אוכלוסיה בשפע. בידודו של תאים אלה מציעה את האפשרות של הלומדים את מעורבותם במחלות לב, ומספק, בנוסף, מודל שימושי התא הראשי לחקור מנגנונים ביולוגיים.
. הנה, מתוארת לשיטת הבידוד של C-MSC מדגימות bioptic arrhythmogenic של שריר הלב המטופלים. דגימה ביופסיה endomyocardial מונחה באזורים חדרית ממש סמוך הצלקת דמיינו ידי מיפוי אלקטרו-אנטומי. עיכול ביופסיות collagenase, ציפוי שלהם על צלחת פלסטיק תרבות בינוני כדי לאפשר צמיחה C-MSC מתואר. ניתן להרחיב את התאים מבודד בתרבות עבור כמה מעברים. כדי לאשר פנוטיפ mesenchymal שלהם, התיאור של אפיון פנוטיפיות שהיו חיסונית קיימות בעבר מסופק. C-MSC מסוגלים להתמיין מספר סוגי תאים כמו adipocytes, chondrocytes, תאי העצם: בהקשר של ACM, מאופיין adipocyte פיקדונות בליבם של המטופלים, הפרוטוקולים עבור הבידול adipogenic של C-MSC ו אפיון של השומנים droplet הצטברות מתוארים.
Introduction
תאי סטרומה mesenchymal (MSC) הם תאים בוגרים עם תפקיד תומכת רקמות רבות1. מח עצם מייצג את מקור היסטורי MSC, אבל הם יכולים להיות מבודד ברקמות שונות כולל השליה, רקמת שומן, דם טבורי, כבד, לב1,2.
בשנת 2006, האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולר (ISCT) צוין, בפעם הראשונה, את הקריטריונים מינימלי כדי להגדיר MSC אנושי3. בפרט, MSC חייב להיות היכולת לדבוק פלסטיק. הם מבטאים אנטיגנים משטח מסוים: הגישה החיובית על סמנים mesenchymal CD44, CD105, CD29, CD90, CD14, CD45, CD34 השליליות, CD31 hematopoietic, אנדותל סמני לאפיין MSC. עקב חוסר ביטוי של ד ר הלע, MSC אינם יכולים לעורר alloreactivity. יתר על כן, הם תאים multipotent עם פוטנציאל להבדיל לכיוון adipogenic, chondrocyte ואוסטאובלסט שושלות1,3.
התמקדות קומפוזיציה הסלולר לב, תאי סטרומה mesenchymal לב (C-MSC) הם בשפע4,הלב למבוגרים נורמליים5. הם ממלאים תפקיד קריטי גם את תפקוד הלב תקין וגם מצבים פתולוגיים. זמן, מבחינה פיזיולוגית, C-MSC לספק microenvironment התומך את שלמות מבנית ופונקציונליים של שריר הלב, מחלות לב הם מופעלים בתגובה לפגיעה בלב המשתתפים ריפוי הפצע ובניה שהותירה6 ,7.
לאחרונה, המעורבות של C-MSC בהתמרה אדיפוז קרדיומיופתיה (ACM) arrhythmogenic כבר הפגינו8. בפרט, ACM היא הפרעה גנטית נגרמת בעיקר מוטציות בגנים desmosomal להוביל החלפת fibro-שומן שריר הלב, בעיקר ב הימני9. החלפה זו, המשתרעת epicardium כדי endocardium, יוצר מצע הלא מוליך מעורר אי ספיקת לב מתקדמת, מחמיר להפרעה, אשר יכול להוביל, במקרים חמורים, למוות פתאומי. . Sommariva et al. הפגינו את מקור mesenchymal adipocytes מראש מתנת בסעיפים הלב explanted ACM המטופלים. יתר על כן, C-MSC מבודד endomyocardial ביופסיות של ACM לבבות desmosomal אקספרס גנים, לכן יכול להיות מושפע שהמוטציות שלהם. בפרט, בתנאים adipogenic, ACM C-MSC לצבור שומנים יותר מאשר אלה של שליטה לבבות. ראיות אלה מובילה למסקנה כי C-MSC יש תפקיד פעיל בפתוגנזה המחלה והן מייצגות מודל חוקיות לתאים ללמוד ACM.
כדי להקל על המחקר העתידי בהקשר זה או מחלות לב אחרות אשר מסומן ביופסיה הלב, פרוטוקול מפורט מוצג עבור בידודו של C-MSC מרסיסים קטן של רקמה endomyocardial, הרחבה שלהם, שלהם חיסונית-פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר אפיון, בידול adipogenic.
Protocol
גישה זו תואם הצהרת הלסינקי והיה האוסף של דוגמאות נכון חדרית (07/06/2012) באישור ועדת האתיקה "Centro Cardiologico Monzino IRCCS".
1. פתרונות
- להפוך TMES בינוני לתרבות C-MSC עם של Iscove שונה Dulbecco בינוני (IMDM), בתוספת 20% סרום שור עוברית (FBS) 10 ננוגרם למ"ל בסיסי פיברובלסט גורם גידול, 10,000 U/mL פניצילין, 10,000 µg/mL סטרפטומיצין, 0.02 M-גלוטמין. לסנן את המדיום TMES באמצעות יחידת מסנן סטרילי מיקרומטר 0.22, ולאחסן ב 4 º C.
- כדי להכין פתרון collagenase, resuspend את המיקס collagenase NB4 בינוני IMDM כדי להשיג פתרון סופי עם ריכוז של 3 מ"ג/מ"ל. מערבולת בעדינות כדי להמיס את האבקה, ולסנן את הפתרון collagenase באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm. Aliquot 1 מ"ל נפח לתוך צינורות סטרילי 2 מ"ל, חנות ב-20 ° C עד הצורך לשימוש.
- להכין טי ADIPO בינוני, להפוך adipogenic בינוני IMDM בינונית בתוספת 10% FBS, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (טרום מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-בריכוז 0.5 M ו שמרו ב-20 ° C עד לשימוש), הידרוקורטיזון 1 מיקרומטר (מדולל מראש ב דימתיל סולפוקסיד ב-100 מ מ יותר ויותר מדולל ל 10 מ מ סטרילי מים מזוקקים ושמר ב-20 ° C עד לשימוש), indomethacin 0.1 מ מ (טרום מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד בריכוז 0.5 M ו שמרו ב-20 ° C עד לשימוש). לסנן המדיום טי ADIPO באמצעות יחידת מסנן סטרילי מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 º C.
- הכנת מאגר כביסה המורכב באגירה פוספט מלוחים מ' 0.0067 פו4 (PBS), חומצה אצטית טטרה ethylenediamine (EDTA) 5 מ מ, אלבומין שור 5% ואת החנות ב 4 º C.
- הכן שמן אדום O (אורו) הפתרון עובד על ידי המסת אבקה אורו של 1% ב- 60% אלכוהול איזופרופיל, ערבוב כבר שעתיים וסינון באמצעות יחידת מסנן מיקרומטר 0.22 להסיר פוחת משקעים. אחסן את הפתרון עובד בטמפרטורת החדר (RT).
2. בידוד של תאי סטרומה Mesenchymal לב
-
ביופסיה לב איסוף ועיבוד
הערה: לפני שתתחיל, ודא כי הפתרון collagenase ואת המדיום TMES מוכן.- לשים את הביופסיה endomyocardial ACM (בדרך כלל כ 5 מ"ג של רקמות) בצינור סטרילי מלא TMES ולהעביר אותה למעבדה.
הערה: ביופסיות ACM נאספים בחדר הניתוח אלקטרופיזיולוגיה, על פי דיווחים קודמים10. בקצרה, השילוב של מיפוי אלקטרו-אנטומי, אקוקרדיוגרפיה intracardiac בתוך החדר הימני (ראה וידאו 1) משמש כדי להנחות את הביופסיה endomyocardial (ראה סרטון 2, fluoroscopy) בהתכתבות לאזור הגבול של שריר הלב הפגוע. דגימות הבקרה (HC) בריא מסופקים על ידי ביו-בנק רקמות, המתקבל הקיר חינם חדרית נכון של תורמים cadaveric בתוך 24 שעות של מוות (מוות מתאונה, לנסיינים בריאים). במהלך ההובלה, לפני ניתוח, לאחסן את הביופסיה ב- TMES ב 4 º C. להגביל את משך הזמן בין ביופסיה איסוף ועיבוד רקמה (מקסימום 24 שעות). - להגדיר את בטיחות ביולוגית ארון עם פתרונות נדרש לבצע את ההליך עד עיכול אנזימטי.
- לשים המעקר מתחת למכסה המנוע ולהדליק את המכשיר 15 דקות לפני השימוש עד שהחום עולה 200-250 מעלות צלזיוס.
- לעקר את המספריים, פינצטה נקצה ס' 10 בטוח המכשירים סטיריליים הם קר לפני השימוש. להכין ואזמלי מנתחים חד פעמי סטרילי.
- מקם את הצינורות עם הביופסיה בשכונה סטרילי. פתח הצינור, להעביר את הביופסיה לתוך צלחת סטרילי.
- לשטוף את הביופסיה הימני פעמיים עם 3 מ"ל של PBS סטרילי. אם אתה רוצה לצלם הביופסיה-המיקרוסקופ.
- להעביר את הביופסיה הימני, באמצעות פינצטה סטרילי, לתוך צינור סטרילי mL 2 המכיל 1 מ"ל של הפתרון collagenase.
- לחתוך את הדגימה 0.5 - 1 מ מ3 חלקים עם מספריים סטרילי.
- תקופת דגירה של 1.5 h ב 37 ° C תחת עצבנות סיבוב רציף.
- Centrifuge הפתרון מתעכל ב 400 g x 10 דקות ב- RT.
- הסר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של PBS סטרילי לשטוף את גלולה.
- צנטריפוגה ב 400 x g 10 דקות ב- RT.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של TMES בינונית.
- צלחת ההשעיה שהושג על גבי צלחת סטרילי תרביות רקמה של 60 מ מ, התייחס ולהוסיף בינוני TMES הנפח הסופי של 3 מ. דגירה על צלחת חממה התרבות התא ב 37 ° C עם 5% CO2.
הערה: נפח גבוה של בינוני עשוי למנוע את הידבקות הנכון של קטעים ביופסיה מעוכל. - לאחר 24 שעות, למחוק את המדיום כדי להסיר תאים שאינם מחסידי ופסולת.
הערה: תאים mesenchymal הפומבית בודדים יכולים לצרף משטח הפלסטיק, להצמיח שיבוטים; בנוסף, שברי מעוכל ביופסיה קטן יכול לצרף צלחת פלסטיק ולאפשר תא הלבלוב. - לשטוף את הצלחת פעמיים עם 5 מ של PBS סטרילי, ולהוסיף 3 מ"ל של מדיום TMES טריים.
- החלף את המדיום TMES שלוש פעמים בשבוע עד התאים הם 80% confluent.
הערה: מספר התאים המצורפת תלוי על האיכות, כמות הרקמה, היעילות של מערכת העיכול.
- לשים את הביופסיה endomyocardial ACM (בדרך כלל כ 5 מ"ג של רקמות) בצינור סטרילי מלא TMES ולהעביר אותה למעבדה.
3. תא הרחבה
הערה: לפני שתתחיל הקפד יש בינוני TMES מוכן.
- כאשר התאים היא העברה confluent, 80% הדגימות מתעכל bioptic קטן לתוך תרבות חדשה 60 מ מ סטרילי רקמות שטופלו לצלחת, להוסיף 3 מ"ל של מדיום TMES טריים.
הערה: הדגימות bioptic יכול להיות שימוש חוזר נוסף C-MSC בידוד. זה אפשרי לחזור על הליך זה עד אין מספר משמעותי של תאים בודדים. - לשטוף את התאים המצורפת פעמיים עם 3 מ"ל של PBS סטרילי. הוסף טריפסין-EDTA פתרון (0.5 mL עבור תבשיל 60 מ מ), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות לאפשר ניתוק התא.
- כאשר התאים הם צמודי קרקע מפני השטח של הצלחת, להוסיף 0.5 מיליליטר FBS סטרילי כדי להשבית את טריפסין ולאסוף תאים לתוך צינור סטרילי 50 מ.
- לשטוף את הצלחת פעמיים עם 5 מ של PBS סטרילי כדי להוסיף את התאים הנותרים הצינור אותו.
- Centrifuge התאים ב 400 g x 10 דקות ב- RT.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של TMES בינונית.
- לטעון µL 10 של התליה תא בתא ספירה קאמרית.
הערה: אם התאים נמצאים גם מרוכז, לדלל את ההשעיה הראשונית 1:10 ב- PBS וטען 10 µL של התאים מדולל בתא ספירה קאמרית. - תחת המיקרוסקופ, לספור תאים 3 ריבועים גדולים וכן על הקווים של שני הצדדים שלהם, לחשב את המספר הממוצע של תאים.
הערה: כדי להשיג את המספר של תאים למ"ל, הממוצע של תאים שנספרו מוכפל ב- 104, הגורם דילול של התא ספירת קאמרית. אם התאים מדוללים נוסף, הכפל עבור הגורם דילול. היחס בין מספר תאי זרע הריכוז תא (מספר תאים למ"ל) מקביל האחסון (ב מ ל) של השעיה הראשונית כדי להיות מצופה לשלב הבא (נקודת 3.9). - צלחת את resuspension על גבי לוחות סטרילי תרביות רקמה של 100 מ מ, יחס-ריכוז סופי של 5,000-10,000 תאי/cm2 ולהוסיף בינוני TMES הנפח הסופי של 8 מ. דגירה את הצלחת ב חממה תרבות התא.
הערה: חזור על הליך הרחבת התא כאשר התאים הם 70-80% confluent. על כל קטע (P), מומלץ cryopreserve חלק התאים ואת צלחת הסכום הנותר. להרחיב את התאים עד P3 או P4 ומשתמשים תא לפעיל על-פלורסנט סדרן (FACS) ניתוח (סעיף 4) ובידול adipogenic (סעיף 5). - עבור הקפאה קריוגנית לאחר הניתוק, centrifuge את התאים ב 400 g x 10 דקות ב- RT.
- ספירת התאים כמו שתוארו (שלבים 3.7-3.8), resuspend עונה 1 פרק 106 תאים µL 900 של FBS סטרילי. להעביר הקפאה-בקבוקון סטרילי ולהוסיף µL 100 של דימתיל סולפוקסיד וסטרילי, לערבב.
- מהר לחנות הבקבוקונים הקפאה לתוך מיכל ההקפאה ב-80 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים ולאחר מכן להעביר את הבקבוקונים לתוך חנקן נוזלי.
4. אפיון של תאי סטרומה Mesenchymal לב מאת Cytometry זרימה
הערה: לפני שתתחיל, ודא שיש תא דיסוציאציה הכימית, שטיפת מאגר ולאחר נוגדנים ספציפיים מוכנים.
- כאשר המספר הנייד מגיע לפחות 3 x 106 (ספירת התאים כפי שמתואר 3.7-3.8), לשטוף את הצלחת 100-מ מ פעמיים עם 10 מ"ל של PBS סטרילי.
- הוסף 5 מ של ריאגנט דיסוציאציה תא והמתן 7-10 דקות ב RT כדי לאפשר ניתוק התא.
- כאשר התאים הם צמודי קרקע מפני השטח של הצלחת, להוסיף 15 מ"ל כביסה סטרילי מאגר ולאסוף את המתלים לתוך צינור סטרילי 50 מ.
- לשטוף את הצלחת פעמיים עם 10 מ"ל לרחוץ את מאגר ולהוסיף את התאים הנותרים הצינור אותו.
- Centrifuge התאים ב 400 g x 10 דקות ב RT, resuspend בגדר ב 1 מ"ל לרחוץ את המאגר.
- נחשב את התאים המתואר (שלבים 3.7-3.8), ולא להעביר 3 x 106 תאים לתוך צינור סטרילי ולהוסיף כביסה מאגר הנפח הסופי של 1.5 mL.
הערה: המספר בתא סכום, הנפח הכולל של מאגר כביסה תלויה מספר סמנים שנבחר משמש את הניתוח (3 x 10 תאים5 µL 100 לכל שפופרת פוליסטירן FACS). - להפיץ µL 100 של השעיה הסלולר 12 שונה FACS צינורות פוליסטירן והוסיפו נוגדן ספציפי-ריכוז המצוין את גליון הנתונים של המוצר.
הערה: נוגדנים המשמש עבור C-MSC אפיון הם CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 ו ד ר הלע (טבלה 1). חשוב להכין את דגימת בקרה המורכבת µL 100 של תאים resuspended צבעונית עם הפקד isotype לבדוק יחודיות של האות. - דגירה בדגימות למשך 15 דקות בחושך.
- להוסיף 1 מ"ל כביסה סטרילי מאגר כל שפופרת לעצור את התגובה.
- Centrifuge התאים ב 400 g x 10 דקות ב- RT.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 250 µL לרחוץ את המאגר.
- המשך C-MSC אפיון עם cytometry זרימה.
5. Adipogenic התמיינות של תאי סטרומה Mesenchymal לב
הערה: לפני שתתחיל, ודא כי הכינו טי ADIPO בינונית, הפתרון עובד אורו.
-
תרבות טי ADIPO בינוני
- ניתוק ולספור את התאים כמתואר בסעיף 3.
- צלחת 3 x 10 תאים5 על גבי כל טוב של תרבות סטרילי של רקמות 6-ובכן מטופלים צלחת ב 2 מ ל ADIPO טי בינוני.
- תן C-MSC להבדיל במדיום טי ADIPO 72 h או 1 בשבוע, שינוי בינוני כל 2-3 ימים.
-
אדום O שמן מכתים
הערה: שימוש שמן אדום O (אורו) צביעת כדי לבדוק הצטברות השומנים ב C-MSC.- מניחים את plateunder תרביות רקמה 6-ובכן למכסה fume.
- להסיר את המדיום adipogenic ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל ל- PBS.
- להוסיף נפח מספיק של 4% paraformaldehyde (PFA) כדי לכסות את כל טוב. לתקן את התאים עבור 5 דקות ב- RT.
- למחוק PFA ולשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל ל- PBS.
- דגירה התאים קבוע עם אורו הפתרון עובד עבור h 1-RT, שימוש באמצעי מספיק כדי לכסות את כל טוב.
הערה: אל תשמור את הצלחת תרביות רקמה 6-ובכן מתחת למכסה המנוע fume במהלך הדגירה אורו כדי למנוע האידוי של הפתרון עובד אורו. - להסיר את כל הפתרון עובד אורו ולשטוף עם 2 מ של PBS 3 - 5 פעמים עד הצלחת נקייה לגמרי; ביטול שוטף. לעצור את מנקי כאשר מגניב היה ברור וכאשר אינך רואה, תחת המיקרוסקופ, לא ספציפי מכתים התאים.
- לכידת 20 תמונות בהגדלה X 20 במשך כל שימוש במיקרוסקופ ניגוד שלב תרביות רקמה הפוכה.
- פתח את התמונות עם התוכנית עיבוד התמונה כדי לכמת את התא הצטברות אורו.
- הפרד את ערוצי צבע שונה באמצעות הפונקציה "לפצל ערוצים" על מנת לכמת רק הזוהר בערוץ 255-אדום.
- לספור את מספר תאים עבור כל תמונה על ידי ספירת הגרעינים. לנרמל את עוצמת האות אורו על המספר הסלולרי.
- לחשב את הממוצע של התוצאות המתקבלות עבור כל תמונה של המדגם אותו.
Representative Results
הלב סטרומה תאים בידוד: הבידוד C-MSC מן ההליך ביופסיות endomyocardial מסוכם באיור1.
הלב סטרומה תאים אפיון mesenchymal: כפי שנקבעו על ידי האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולר (ISCT), הקריטריונים מינימלי עבור הגדרת multipotent תאי סטרומה mesenchymal כולל אפיון פנוטיפי-חיסונית שלהם3. בפרט, כדי לאשר את השושלת mesenchymal, תאי הדגירה עם נוגדנים FITC/PE/APC-מצומדת המתאים, נותחו על ידי cytometry זרימה. כל הנוגדנים בשימוש האפיון C-MSC מפורטים בטבלה של חומרים.
כמופיע באיור2, C-MSC המתקבל ביופסיות הן חיוביות עבור ספציפי mesenchymal משטח אנטיגנים CD29, CD44 ו- CD105. אחוז תאים חיוביים CD90 הוא משתנה, כפי שדווח בעבר11. אנדותל (CD31, CD34), מונוציט/מקרופאג (CD14), hematopoietic (CD45) סמנים הגדולות histocompatibility מורכבים (הלע ד ר) הן לא הביע (איור 2).
לב mesenchymal תאי סטרומה adipogenic בידול: כדי לבקש את הבידול adipogenic שלהם, C-MSC המתקבל חולי מושפע ACM, HC חייב להיות בתרבית טי ADIPO בינוני (ראו סעיף פתרונות). התאים מתוחזקים בתרבות 72 h או 1 בשבוע, מחליף המדיום פעמיים בשבוע.
ההצטברות של שומנים בדם תאיים טיפות שמעידים אורו מכתים (איור 3). יכול להיות שנצפו ההבדלים היכולת, וכן את מידת התמיינות, בין התאים המתקבל ACM, HC. כפי שמוצג בתמונות נציג, ACM C-MSC מצטבר טיפות השומנים יותר מאשר HC C-MSC לאחר 72 h של תרבות adipogenic בינוני (איור 3). הבדלים אלה נשמרים גם כאשר התאים חשופים לתנאי בידול adipogenic לתקופה ארוכה יותר (שבוע 1) (איור 3).
וידאו 1: שילוב של electroanatomical מפה אקוקרדיוגרפיה intracardiac. Endocardial unipolar electroanatomical מפות של החדר הימני (השמאלי הקדמי המלוכסן נכון הקדמי המלוכסן ותצוגת) לחולה אשר עובר ביופסיה endomyocardial (לוחות נמוכה יותר). באזורים מוגבלים של מתח נמוך (אדום/ירוק) גלויים-השיא. Endomyocardial bioptic דגימות (כמו העיגול) נאספים בהתכתבות שריר הלב הפגוע, מחצה interventricular. אקוקרדיוגרפיה intracardiac בזמן אמת מאפשר לבדוק את המיקום הנכון של bioptome באזור היעד (החלונית העליונה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
2 וידאו: Fluoroscopy וידאו בתצוגה אלכסונית נכון הקדמי. Bioptome הוא מוכנס דרך נדן ארוך-deflectable ומתקדם לתוך החדר. לאחר בדיקה של איש הקשר bioptome עם שריר הלב, הלסתות הנפתחים ונסגרים ואז בחוזקה כדי לאסוף את הדגימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
איור 1: הליך הגיוס. הדוגמה bioptic endomyocardial נאסף באמצעות צנתר bioptome, כלי חיתוך בצורת מלקחיים קטנים. המשקל של הביופסיה שהושג הוא כ- 5 מ ג (A). הדוגמה bioptic endomyocardial הוא טחון אל תוך 0.5 - 1 מ מ3 שברים, במספריים סטרילי (B), והוסיף collagenase פתרון. המדגם ימוקם חממה 37 ° C על מערבל פלטפורמה מסתובבת עבור h 1.5 של מערכת העיכול (C). הפתרון מתעכל centrifuged, מצופה ב TMES בצלחת פלסטיק (D). C-MSC מתקבלים בזכות תכונותיהם הדבקות מפלסטיק או תאים בודדים או שיבוטים, או מגיחה קטן שברי bioptic מעוכל (E). C-MSC מאופיינים ואז cytometry זרימה (F). C-MSC הן מצופה adipogenic בינוני, הצטברות שומנים בדם droplet נבדק על ידי O אדום שמן מכתים (G). סולם מציינות 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: fluorimetric-cyto נציג פרופיל של C-MSC. כל היסטוגרמה מציגה את ספירת לעומת עוצמת קרינה פלואורסצנטית בערוץ שצוין (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate). סמן משטח נוגדנים (אדום) מוצגים כל גרף את הפקד isotype (לבן) ואת מדגם מצומדת עם התא הספציפי. C-MSC הן חיוביות mesenchymal משטח אנטיגנים CD29, CD44, CD105 ועבור, באופן חלקי, CD90, ואילו הם שאינם מבטאים CD31 ', ' CD34 ', ' CD14 ', CD45, ד ר הלע אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Adipogenic הבידול של C-MSC. להחליפן בתמונות של ACM, HC C-MSC, תרבותי adipogenic בינוני עבור 72 h ושבוע 1, מוכתם אורו (תמונות שמאל; n = 3). בגרפים נכון, כימות של הזוהר של ההכתמה 255-אדום ערוץ דיווח: העוצמה מבוטאת ביחידות שרירותי (א"א). ACM C-MSC לצבור עוד טיפות השומנים יותר שולטת. מבחן T של סטודנט שימש, *: p < 0.05. סולם מציינות 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
MSC ו- C-MSC: MSC הם באזור השבר סטרומה של רקמות בוגרות שונים, כגון מח העצם, רקמת שומן, סחוס, המוח, העור, נספחים עוברי ו לב12multipotent תאים. מחקרים שונים שנעשו כדי לבודד ולאפיין אותם עבור יישומים פוטנציאליים מחקר בסיסי והתרגום12,13.
בתנאים בריא, MSC הם השבתה הדרגתית, עצמי המתחדש הנמוכים14. מאז הם נחשפים לשינויים סביבתיים פתולוגיים הם מגיבים להשכין רקמות דרך transdifferentiation ישירה, מטריקס התצהיר, או אפקט paracrine14.
MSC הלב (C-MSC) מייצגים אוכלוסיה תא גדול הלא-myocyte של הלב4. מקורן epicardium והם נודדים אל שריר הלב שעברו התהליך של מעבר אפיתל-אל-mesenchymal15. הם תורמים מכניים וחשמליים בשלמות מבנה הלב, פיזיולוגית והן במצבים פתולוגיים, דרך אינטראקציות עם cardiomyocytes ו מטריצה חוץ-תאית הומאוסטזיס7,16. עם זאת, הפונקציות רחב טווח של C-MSC עדיין לא לגמרי מובן. ידע רב תפקידם שניהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים ניתן להקל על ידי מחקרים במבחנה לבצע לאחר הבידוד שלהם.
C-MSC הושגו מן הרובעים השונים של הלב האנושי, כגון פרפור גפה2,17 , החדר הימני18.
לאחרונה, C-MSC מדגימות bioptic endomyocardial חדרית ממש אנושי הושגו8, הוכחת כי רקמת המקור יכול להיות קצת כמו 3-5 מ ג.
יישומים אפשריים: השיטה המתוארים בכתב יד זה מאפשר קבלת תאים עם כמה קטעים פשוטים, כגון עיכול ומבחר ב"זכות פלסטיק, מן הלב קטן מאוד דגימות.
C-MSC יכול להיחשב מודל תא, שכן הם קלים להגביר ולשמור במבחנה, והם מסוגלים להבדיל לתוך תאים של השושלת mesenchymal (אנדותל, osteocytes ו- adipocytes). יתר על כן, האפשרות של קבלת תאים ישירות מחולים מהווה כלי נהדר במבחנה ללימודי מכניסטית בהקשר של רפואה אישית/דיוק. אכן, תאים אלה נושאים רקע גנטי של מוטציות ספציפיות בסופו של דבר התורמים, והם מושפעים על ידי מאפיינים המטופלים ספציפיים, כגון תנאים קליניים, גיל, מין, סגנון חיים, ותרופות. יתר על כן, האפשרות של מיון עבור סמנים שונים עשוי לאפשר המחקר של C-MSC ספציפי קבוצות משנה19.
C-MSC ידועים להיות שחקנים פעילים שונים מחלות לב וכלי דם, מאופיין בעיקר על ידי שיפוץ לוואי של הלב. לכן, הם מייצגים את המועמד מטרות אסטרטגיות טיפוליות מקוריות לנטרל מחלות לב8,20.
תכונות גזע כמו C-MSC, שלהם חוסר משמעותי immunogenicity מצביע על פוטנציאל היישום שלהם בטיפול תא עבור רפואה רגנרטיבית הלב. אכן, כמו MSC מח עצם או מקורות אחרים, C-MSC שעלול לשמש עצמיים והן בהגדרות allogenic, ללא צורך התאמה בין התורם ובין נמענים21.
יתר על כן, C-MSC, מבודד ישירות מתוך רקמת הלב, יש את היתרון של להיות preconditioned על ידי סביבת מיקרו לב פרופיל epigenetic. בהקשר של רפואה רגנרטיבית הלב, זה יכול להיות חשוב במיוחד להשיג תוצאות מוצלחות.
עד היום מחקרים פרה של רפואה רגנרטיבית לזהות את הפוטנציאל הטיפולי שימושי ב C-MSC ו שלהם paracrine פעילות18,22,23. חשוב, ניסויים קליניים שבו המקור התא הוא הלב נערכים עם תאים cardiosfere, נגזר או עם subpopulations של C-MSC13,24,25. עם זאת, לגבי עצם מח-נגזר MSC, פרוטוקולים שונים ייתכן שיהיה צורך לקבל קליניים כיתה ג-MSC26.
C-MSC ב- ACM: פרוטוקול הציג מתאים בעיקר בחקר פתולוגיות אשר מסומן ביופסיית endocardial. ACM המטופלים עוברים bioptic נהלי למטרות אבחון27. שריר הלב שלהם מוחלף בהדרגה על ידי רקמת צלקת, רקמות אינרטי חשמלית מורכבת adipocytes פיברוזיס. על מנת להנחות את הדגימה bioptic באזור הצלקת, שם התשואה האבחון הוא מקסימלי, מיפוי endomyocardial הוא בשימוש10,28,29. הדגימות בשימוש פרוטוקול זה נלקחים לאזור הגבול של שריר הלב הפגוע.
. Sommariva et al. הגדיר לאחרונה תפקיד מרכזי של C-MSC בפתוגנזה של ACM8, הוכחת כי C-MSC הם שחקנים פעילים ב- ACM adipogenesis לב, מאחר preadipocytes בלבבות האלה הם ממוצא mesenchymal. יתר על כן, C-MSC מבודדים עם פרוטוקול הנוכחי של ביופסיות של ACM חולים הראו נטיה יותר הצטברות שומנים בדם והן adipogenesis יותר שולטת. מסיבה זו, תאים אלה ניתן להשתמש כדי לאשר חלק המנגנונים המולקולריים של ACM, מוכיח להתאמתם כמודל תא עבור מחקרים מכניסטית9.
מגבלות והשלבים קריטי: למרות היתרונות של קבלת C-MSC ישירות מחולים (ראה הפיסקה "יישומים אפשריים"), פרוטוקול זה נענשים מגבלות שונות.
קודם כל, הנוהל bioptic הלב אינו פולשני, לעיתים קרובות להימנע אם לא הכרחי. אכן, דגימה ברקמת הלב הוא בעייתי מבחינה מוסרית והן מבחינה טכנית. הסיבות לביצוע ביופסיה לב ייתכן ההישג של אבחנה ברורה בהקשר של cardiomyopathies, אבחנה מבדלת, מנטר את מצבו של השתלות לב, או הנוכחות של גידול הלב30ברור. לכן, יכול להיות רשום רק חולים אשר ביופסיית endomyocardial שציין הצהרת הסכמה31 לחקר C-MSC. יתר על כן, ההליך bioptic לב יכולים להיות סיבוכים קליניים, ומעל הכל בליבם cardiomyopathic. לכן, samplings של electrophysiologist הם תמיד זהיר, דוגמאות bioptic יכול להיות קטן מאוד, להתפשר על הבידוד של תאים. ניסויים עתידיים יכול להתגבר על בעיה זו על-ידי כוונון collagenase ריכוז או בתזמון של מערכת העיכול.
C-MSC, כמו כל ראשי תאים אנושיים, מראים השתנות גבוהה בין נושאים שונים פנוטיפים כל. ואכן, תאים מן הנבדקים שונים הם לא רק שונות גנטית, אלא גם וכפופים להתניה סביבתיים משתנים. באופן ספציפי, במסגרת הניסוי השתנות גבוהה בתאית התמיינות בידוד, צמיחה, adipogenic הוא ציין.
שלבים קריטיים של הפרוטוקול הנוכחי יש להיות מוערך. אם הדגימה bioptic כולל נימים, יש להרחיק כדי למנוע את הבידוד מקבילים של תאי אנדותל, אשר עשויים לזהם את התרבות C-MSC, והוא יכול להיות שמעידים הניתוח FACS (חיוביות עבור CD31). כדי להשיג בידול של adipogenic יעיל, התאים להיות בשלב הצמיחה הפעילה. מידת הנהרות עשויים להשפיע גם הצטברות שומנים בדם.
משמעות השיטה: לגבי שיטות קודמות של בידוד תאי סטרומה mesenchymal, זו הפעם הראשונה היכן התיאור של obtainment C-MSC ישירות מדגימות האנושי bioptic חדרית מוצע בפירוט. אמנם שיטה זו הוא הציע עיבוד הדגימות החולה ACM, זה להחלה כל המטופלים אשר מסומן ביופסיה הלב.
פרוטוקול זה מייצג את יישום שימושי של שיטות קודמות הקניית התאים הדרושים דגימות לב גדול32, לעתים קרובות קשה לאסוף.
יתר על כן, מקור הדגימה מהווה חידוש מעניין. בזמן הביופסיה חדרית מתבצע בדרך כלל על מחצה33, פרוטוקול זה לוקח דגימות חשבון המתקבל הקיר חינם ממש חדרית. תאים שמקורם רובע חדרית ממש חולה יכול להיות נציג נוסף של מצב פיפטות של מחלות הקשורות לקרוואן
בנוסף, חלק ריאגנטים בשימוש בפרוטוקול הנוכחי שונים ביחס אחרים C-MSC בידוד ובידול שיטות32. לדוגמה, סוג collagenase הציע בכתב היד הוא שילוב של מחלקה אני ושיעור II collagenases עם יחס מאוזן של פעילויות הפרוטאוליטי. יתר על כן, הפתרון העיכול מורכב המיקס collagenase מומס באותו הבזליים המדיום (IMDM) המשמש את הכנת C-MSC תרבות בינוני, ומאפשר מבודד C-MSC להסתגל לתנאי הגידול העתידי.
בנוסף, למרות מיון הליכים יכול לתקנן את האצווה תא, באמצעות האוכלוסייה C-MSC, מבודד רק באמצעות המאפיין הדבקות מפלסטיק של תאים אלה, מהווה פישוט מבלי לשנות את immunophenotypic מאפייני C-MSC. ההרכב של טי ADIPO הציע בכתב היד הוא מסוגל להוביל בידול adipogenic, הימנעות את dysregulation מטבולית הנגרמת על-ידי רכיבים אחרים כמו אינסולין.
יתר על כן, השיטה המוצעת של כימות הצטברות שומנים בדם, אשר מבוסס על הערכת עוצמת אורו ערכי צבע מוחלטים, מספקת מידע נוסף אודות כמות ליפידים שהצטברו, אם לעומת שיטות בהתבסס רק על אחוז תאים חיוביים ההכתמה אורו. לעיתים קרובות הצטברות שומנים בדם הוא לכמת על-ידי חילוץ את אורו שולבו על ידי תאים עם אלכוהול איזופרופיל ומדידת ספיגת שלה. אולם, שיטה זו דורשת יותר מעברים, הוא נתון השתנות בשל התאיידות אלכוהול איזופרופיל.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי האיטלקי של משרד הבריאות, החיפוש אחר Corrente כדי Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
- Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
- Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
- Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
- Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
- Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
- Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
- Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745 (2016).
- Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
- Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513 (2011).
- Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
- Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
- Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512 (2014).
- Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
- Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
- Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
- Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
- Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
- From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S.
