इस लेख में, arrhythmogenic cardiomyopathy रोगियों के endomyocardial bioptic नमूनों से कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान की गई है । उनके लक्षण वर्णन और प्रोटोकॉल उनके adipogenic भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए वर्णित हैं ।
एक सामांय वयस्क दिल कई विभिंन प्रकार के सेल, जो बीच में कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं एक प्रचुर मात्रा में जनसंख्या का प्रतिनिधित्व से बना है । इन कोशिकाओं के अलगाव हृदय रोगों में उनकी भागीदारी का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है, और इसके अलावा, जैविक तंत्र की जांच करने के लिए एक उपयोगी प्राथमिक सेल मॉडल प्रदान करता है ।
इधर, arrhythmogenic cardiomyopathy मरीजों के bioptic नमूनों से सी-एमएससी के अलगाव के लिए विधि बताई गई है । endomyocardial बायोप्सी नमूना सही वेंट्रिकुलर इलेक्ट्रो-संरचनात्मक मानचित्रण द्वारा visualized निशान करने के लिए आसंन क्षेत्रों में निर्देशित है । collagenase में बायोप्सी के पाचन और संस्कृति माध्यम में एक प्लास्टिक डिश पर उनके चढ़ाना सी एमएससी वृद्धि की अनुमति वर्णित है । अलग कोशिकाओं कई मार्ग के लिए संस्कृति में विस्तारित किया जा सकता है । उनके mesenchymal phenotype की पुष्टि करने के लिए इंयूनो-phenotypical लक्षण वर्णन का विवरण प्रदान किया गया है । सी-एमएससी adipocytes, chondrocytes, और osteoblasts जैसे कई कोशिका प्रकार में अंतर करने में सक्षम हैं: ACM के संदर्भ में, रोगियों के दिलों में adipocyte जमा की विशेषता, सी के adipogenic भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल-एमएससी और लिपिड छोटी बूंद संचय के लक्षण वर्णन कर रहे हैं ।
Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (एमएससी) कई ऊतकों में एक महत्वपूर्ण सहायक समारोह के साथ वयस्क कोशिकाओं रहे हैं1. अस्थि मज्जा एमएससी के ऐतिहासिक स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन वे अपरा, वसा ऊतक, गर्भनाल रक्त, जिगर, और दिल1,2सहित विभिन्न ऊतकों से अलग किया जा सकता है ।
२००६ में, सेलुलर थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी (ISCT) निर्दिष्ट, पहली बार के लिए, ंयूनतम मानदंड मानव एमएससी3को परिभाषित करने के लिए । खास तौर पर एमएससी में प्लास्टिक का पालन करने की क्षमता होनी चाहिए । वे विशिष्ट सतह एंटीजन व्यक्त: CD44, CD105, CD29, और CD90 mesenchymal मार्करों के लिए धनात्मकता, और CD14, CD45, CD34, CD31 टेम और endothelial मार्करों के लिए नकारात्मकता एमएससी की विशेषताएं । एचएलए की कमी की अभिव्यक्ति के कारण-डॉ, एमएससी alloreactivity ट्रिगर करने में असमर्थ हैं । इसके अलावा, वे adipogenic, chondrocyte, और osteoblast वंश1,3की ओर अंतर करने की क्षमता के साथ multipotent कोशिकाओं रहे हैं ।
कार्डिएक सेलुलर संरचना पर ध्यान केंद्रित, कार्डियक mesenchymal stromal कोशिकाओं (सी-एमएससी) एक सामान्य वयस्क दिल में प्रचुर मात्रा में हैं4,5. वे दोनों सामांय हृदय समारोह और रोग की स्थिति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । जबकि, शारीरिक, सी-एमएससी एक microenvironment कि मायोकार्डियम के संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता का समर्थन करता है प्रदान करते हैं, हृदय रोगों में वे दिल की चोट के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं घाव भरने में भाग लेने और fibrotic remodeling6 ,7.
हाल ही में, arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM) वसा प्रतिस्थापन में सी-एमएससी के शामिल होने से8का प्रदर्शन किया गया है । विशेष रूप से, ACM एक आनुवंशिक विकार मुख्य रूप से desmosomal जीन में परिवर्तन की वजह से है कि रोधगलन fibro-फैटी प्रतिस्थापन के लिए सीसा, मुख्य रूप से सही निलय9में है । इस प्रतिस्थापन, epicardium से endocardium तक का विस्तार, एक गैर प्रवाहकीय सब्सट्रेट है कि प्रगतिशील दिल की विफलता को बढ़ाता है और वेंट्रिकुलर अतालता, जो नेतृत्व कर सकते हैं बिगड़ जाती है बनाता है, गंभीर मामलों में, अचानक मौत के लिए. Sommariva एट अल. ACM मरीजों के explanted हृदय वर्गों में उपस्थित पूर्व adipocytes के mesenchymal मूल का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, सी-एमएससी ACM दिल desmosomal जीन एक्सप्रेस के endomyocardial बायोप्सी से अलग है और इसलिए उनके उत्परिवर्तनों से प्रभावित किया जा सकता है । विशेष रूप से, adipogenic शर्तों के तहत, ACM सी एमएससी नियंत्रण दिल से उन से अधिक लिपिड जमा । इस सबूत के निष्कर्ष है कि सी-एमएससी दोनों रोग रोगजनन में एक सक्रिय भूमिका है और ACM का अध्ययन करने के लिए एक वैध सेल मॉडल का प्रतिनिधित्व करने की ओर जाता है ।
इस संदर्भ में या अंय हृदय रोग है जिसके लिए एक हृदय बायोप्सी संकेत दिया है में भविष्य के अनुसंधान की सुविधा के लिए, एक विस्तृत प्रोटोकॉल endomyocardial ऊतक के छोटे टुकड़े से सी-एमएससी के अलगाव के लिए प्रस्तुत किया जाता है, उनके विस्तार, उनके इंयूनो-phenotypical लक्षण वर्णन, और adipogenic भेदभाव ।
एमएससी और सी-एमएससी: MSC विभिंन वयस्क ऊतकों के stromal अंश में निवासी multipotent कोशिकाओं रहे हैं, जैसे अस्थि मज्जा, वसा ऊतक, उपास्थि, मस्तिष्क, त्वचा, भ्रूण एनेक्सी, और दिल12. विभिंन अध्ययनों को अलग और उंहें बुनियादी और शोधों अनुसंधान12,13में संभावित अनुप्रयोगों के लिए विशेषताएं प्रदर्शन किया गया है ।
स्वस्थ परिस्थितियों में एमएससी कम दर14पर quiescent, स्व-नवीनीकरण कर रहे हैं । वे पर्यावरणीय रोग परिवर्तन करने के लिए उजागर कर रहे हैं के बाद से, वे या तो प्रत्यक्ष transdifferentiation, मैट्रिक्स जमाव, या paracrine प्रभाव14के माध्यम से remodeling ऊतक को बढ़ावा देने प्रतिक्रिया.
कार्डिएक एमएससी (सी-एमएससी) दिल की एक बड़ी गैर myocyte सेल जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं4. वे epicardium से उत्पंन और उपकला-से-mesenchymal संक्रमण15की प्रक्रिया के दौर से गुजर मायोकार्डियम में विस्थापित । वे दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में, cardiomyocytes और extracellular मैट्रिक्स homeostasis7,16के साथ बातचीत के माध्यम से, हृदय संरचना के यांत्रिक और विद्युत अखंडता के लिए योगदान करते हैं । हालांकि, सी-एमएससी के कार्यों की व्यापक रेंज अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आ रही है । दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में उनकी भूमिका का एक गहरा ज्ञान की सुविधा के द्वारा किया जा सकता है में इन विट्रो अध्ययन उनके अलगाव के बाद प्रदर्शन किया ।
सी-एमएससी मानव हृदय के विभिंन जिलों से प्राप्त किया गया है, जैसे अलिंद पीछे2,17 और दाएं निलय18।
हाल ही में, सी-एमएससी ह्यूमन राइट वेंट्रिकुलर endomyocardial bioptic नमूनों से8प्राप्त किया गया है, का प्रदर्शन है कि स्रोत ऊतक के रूप में के रूप में छोटा हो सकता है 3-5 मिलीग्राम.
संभावित अनुप्रयोग: इस पांडुलिपि में उल्लिखित विधि कुछ सरल मार्ग के साथ कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति देता है, ऐसे पाचन और प्लास्टिक पालन के लिए चयन के रूप में, बहुत छोटे दिल नमूनों से.
सी-एमएससी एक सेल मॉडल माना जा सकता है, क्योंकि वे बढ़ाना आसान कर रहे है और इन विट्रो मेंबनाए रखने, और mesenchymal वंश की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम है (endothelium, osteocytes, और adipocytes) । इसके अलावा, रोगियों से सीधे कोशिकाओं को प्राप्त करने की संभावना का गठन एक महान इन विट्रो उपकरण के संदर्भ में यंत्रवत अध्ययन के लिए व्यक्तिगत/परिशुद्धता दवा. दरअसल, इन कोशिकाओं आनुवंशिक पृष्ठभूमि और अंततः दाताओं के विशिष्ट उत्परिवर्तनों ले, और इस तरह के नैदानिक स्थितियों, उंर, लिंग, जीवन शैली, और दवाओं के रूप में विशिष्ट रोगियों ‘ विशेषताओं, से प्रभावित हैं । इसके अलावा, उंहें अलग मार्करों के लिए छंटाई की संभावना विशिष्ट सी के अध्ययन-MSC सबसेट19सेट की अनुमति हो सकती है ।
सी-एमएससी के लिए विभिंन हृदय रोगों में सक्रिय खिलाड़ी, ज्यादातर दिल के प्रतिकूल remodeling की विशेषता जाना जाता है । इसलिए, वे8,20दिल रोगों प्रतिक्रिया करने के लिए उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए उंमीदवार के लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
सी-एमएससी स्टेम गुणों की तरह है और उनके महत्वपूर्ण immunogenicity की कमी कार्डियक अपक्षयी दवा के लिए सेल थेरेपी में अपने संभावित आवेदन पता चलता है । वास्तव में, अस्थि मज्जा या अंय स्रोतों से एमएससी की तरह, सी-एमएससी संभवतः दोनों ऑटोलॉगस में और allogenic सेटिंग्स में इस्तेमाल किया जा सकता है, दाता और प्राप्तकर्ता21के बीच मिलान के लिए की आवश्यकता के बिना ।
इसके अलावा, सी-एमएससी, सीधे दिल के ऊतकों से अलग किया जा रहा है, कार्डियक माइक्रो पर्यावरण और epigenetic प्रोफ़ाइल द्वारा वातानुकूलित होने का लाभ है । कार्डियक अपक्षय चिकित्सा के संदर्भ में, यह विशेष रूप से सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है ।
तिथि करने के लिए, reअपक्षय चिकित्सा के नैदानिक अध्ययन सी-एमएससी और उनके paracrine गतिविधि में उपयोगी चिकित्सीय क्षमता की पहचान की18,22,23। महत्वपूर्ण बात, नैदानिक परीक्षण जिसमें सेल स्रोत दिल है या तो cardiosfere-व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ या सी के उपजनसंख्याों के साथ चल रहे हैं-एमएससी13,24,25. हालांकि, अस्थि मज्जा-एमएससी प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रोटोकॉल नैदानिक ग्रेड सी-एमएससी26प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
ACM में सी-एमएससी: प्रस्तुत प्रोटोकॉल ज्यादातर विकृतियों के अध्ययन के लिए उपयुक्त है जिसके लिए एक endocardial बायोप्सी दर्शाई गई है । ACM रोगियों नैदानिक प्रयोजनों के लिए bioptic प्रक्रियाओं से गुजरना27. उनके मायोकार्डियम धीरे-adipocytes और फाइब्रोसिस से बना निशान ऊतक, एक विद्युत निष्क्रिय ऊतक द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । आदेश में bioptic नमूना क्षेत्र है, जहां नैदानिक उपज अधिक से अधिक नमूने के लिए मार्गदर्शन करने के लिए, endomyocardial मानचित्रण10,28,29प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए नमूनों को रोगग्रस्त मायोकार्डियम के सीमा क्षेत्र में ले जाया जाता है ।
Sommariva एट अल. हाल ही में ACM8के रोगजनन में सी-एमएससी के एक निर्णायक भूमिका को परिभाषित किया है, का प्रदर्शन है कि सी-एमएससी ACM हार्ट adipogenesis में सक्रिय खिलाड़ी हैं, के बाद से उन दिलों में preadipocytes mesenchymal मूल के हैं । इसके अलावा, सी-एमएससी ACM ‘ रोगियों बायोप्सी से वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ अलग दोनों लिपिड संचय और नियंत्रण से adipogenesis के लिए और अधिक प्रवृत्ति दिखाई । इस कारण से, इन कोशिकाओं ACM के आणविक तंत्र के कुछ पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यंत्रवत अध्ययन के लिए एक सेल मॉडल के रूप में अपनी उपयुक्तता साबित9।
सीमाएं और महत्वपूर्ण चरण: रोगियों से सी-एमएससी सीधे प्राप्त करने के लाभ के बावजूद (पैरा “संभव अनुप्रयोगों” देखें), इस प्रोटोकॉल अलग सीमाओं के अधीन है ।
सबसे पहले, हृदय bioptic प्रक्रिया आक्रामक है और अक्सर अगर सख्ती से आवश्यक नहीं बचा । दरअसल, हृदय ऊतक नमूने दोनों नैतिकता की दृष्टि से और तकनीकी रूप से समस्याग्रस्त है । एक हृदय बायोप्सी प्रदर्शन के लिए कारण विभेदक निदान में cardiomyopathies के संदर्भ में एक निश्चित निदान की उपलब्धि हो सकती है, हृदय प्रत्यारोपण की स्थिति की निगरानी, या एक दिल ट्यूमर की उपस्थिति का पता लगाने30. इसलिए, केवल रोगियों जिसके लिए एक endomyocardial बायोप्सी आम सहमति कथन द्वारा संकेत दिया जाता है31 C-MSC पर अनुसंधान के लिए नामांकित किया जा सकता है । इसके अलावा, हृदय bioptic प्रक्रिया नैदानिक जटिलताओं, cardiomyopathic दिलों में सब से ऊपर हो सकता है । इसलिए, electrophysiologist के नमूने हमेशा सतर्क रहे है और bioptic नमूनों बहुत छोटा हो सकता है, कोशिकाओं के अलगाव समझौता । भविष्य के प्रयोगों collagenase एकाग्रता या पाचन के समय ट्यूनिंग द्वारा इस मुद्दे पर काबू पाने सकता है ।
सी-एमएससी, सभी प्राथमिक मानव कोशिकाओं के रूप में, सभी phenotypes में विभिन्न विषयों के बीच एक उच्च परिवर्तनशीलता दिखाएँ. वास्तव में, विभिंन विषयों से कोशिकाओं को न केवल आनुवंशिक रूप से अलग हैं, लेकिन यह भी चर पर्यावरण कंडीशनिंग के अधीन । विशेष रूप से, इस प्रयोग के भीतर, कोशिका अलगाव, विकास, और adipogenic विभेद में एक उच्च परिवर्तनशीलता मनाया जाता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम को स्वीकार करना होगा । यदि bioptic नमूना केशिकाओं शामिल हैं, वे endothelial कोशिकाओं है, जो सी-एमएससी संस्कृति दूषित हो सकता है के समानांतर अलगाव से बचने के लिए हटाया जाना चाहिए, और FACS विश्लेषण (CD31 के लिए धनात्मकता) द्वारा सबूत हो सकता है । एक कुशल adipogenic भेदभाव प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को एक सक्रिय विकास के दौर में होना चाहिए । संगम की डिग्री भी लिपिड संचय को प्रभावित कर सकते हैं ।
विधि का महत्व: mesenchymal stromal कोशिकाओं के अलगाव के पिछले तरीकों के संबंध में, यह पहली बार है जहां मानव वेंट्रिकुलर bioptic नमूनों से सीधे सी एमएससी प्राप्त करने का विवरण विस्तार में प्रस्तावित है । हालांकि इस विधि ACM रोगी के नमूनों के प्रसंस्करण के लिए सुझाव दिया है, यह संभवतः सभी रोगियों जिसके लिए एक हृदय बायोप्सी इंगित है करने के लिए लागू है ।
इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं है कि बड़े कार्डियक नमूने३२, जो अक्सर इकट्ठा करने के लिए मुश्किल है की आवश्यकता के प्राप्य के लिए पिछले तरीकों के एक उपयोगी कार्यांवयन का प्रतिनिधित्व करता है ।
इसके अलावा, नमूना स्रोत एक दिलचस्प नवाचार का गठन किया । जबकि वेंट्रिकुलर बायोप्सी आमतौर पर पट३३पर किया जाता है, इस प्रोटोकॉल खाते में सही वेंट्रिकुलर मुक्त दीवार से प्राप्त नमूनों में लेता है । वेंट्रिकुलर जिले से प्राप्त कोशिकाओं के रोग की स्थिति के अधिक प्रतिनिधि हो सकता है RV शामिल आर. एस.
इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया एजेंट के कुछ अंय सी के संबंध में अलग है-एमएससी अलगाव और भेदभाव विधियों३२। उदाहरण के लिए, इस पांडुलिपि में प्रस्तावित collagenase के प्रकार proteolytic गतिविधियों के एक संतुलित अनुपात के साथ कक्षा मैं और कक्षा द्वितीय collagenases का मिश्रण है । इसके अलावा, पाचन समाधान collagenase एक ही बेसल मध्यम (IMDM) सी-एमएससी संस्कृति माध्यम की तैयारी के लिए इस्तेमाल में भंग मिश्रण से बना है, अलग सी की अनुमति-एमएससी भविष्य के विकास की स्थिति के लिए अनुकूल है ।
इसके अलावा, हालांकि छंटाई प्रक्रियाओं सेल बैच मानकीकरण सकता है, पूरे सी-एमएससी जनसंख्या का उपयोग कर, केवल इन कोशिकाओं के प्लास्टिक पालन संपत्ति के माध्यम से पृथक, immunophenotypic फेरबदल के बिना एक सरलीकरण का गठन सी के लक्षण-एमएससी । इस पांडुलिपि में प्रस्तावित ADIPO की संरचना adipogenic विभेद करने के लिए नेतृत्व करने में सक्षम है, इंसुलिन जैसे अन्य घटकों द्वारा प्रेरित चयापचय dysregulation से परहेज.
इसके अलावा, लिपिड संचय ठहराव, जो ओरो वर्णमिति तीव्रता के मूल्यांकन पर आधारित है की प्रस्तावित विधि, संचित लिपिड की मात्रा के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है, यदि केवल प्रतिशत पर आधारित तरीकों के साथ तुलना की कोशिकाओं ओरो धुंधला करने के लिए सकारात्मक । अक्सर लिपिड संचय isopropanol के साथ कोशिकाओं द्वारा शामिल ओरो निकालने और इसके अवशोषण को मापने के द्वारा quantified है । हालांकि, इस विधि और अधिक मार्ग की आवश्यकता है और isopropanol वाष्पीकरण के कारण परिवर्तनशीलता के अधीन है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था, Ricerca Corrente को Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
ImageJ (image processing program) | NIH | ||
Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |