Un modèle de souris syngénique Cancer du pancréas pour étudier les effets de l’électroporation irréversible
Summary
Électroporation irréversible (IRE) est une technique d’ablation non thermique utilisée pour le traitement du cancer du pancréas localement avancé. Etant une technique relativement nouvelle, les effets de l’IRE sur la croissance de tumeur sont mal compris. Nous avons développé un modèle de souris syngénique qui facilite l’étude des effets des IRE sur le cancer du pancréas.
Abstract
Cancer du pancréas (PC), une maladie qui tue environ 40 000 patients chaque année aux Etats-Unis, a échappé avec succès plusieurs approches thérapeutiques, y compris les stratégies immunothérapeutiques prometteurs. Électroporation irréversible (IRE) est une technique d’ablation non thermique qui induit la mort des cellules tumorales sans destruction des structures adjacentes de collagènes, permettant ainsi la procédure à effectuer dans les tumeurs très proche des vaisseaux sanguins. Contrairement aux techniques d’ablation thermique, IRE se traduit par la mort cellulaire par apoptose progressive, ainsi que l’ablation immédiate induite par nécrose et est actuellement dans l’utilisation clinique des patients sélectionnés avec PC localement avancé. Un ablatif, procédure spécifique non ciblés comme IRE peut induire une myriade de réponses dans le microenvironnement tumoral. Quelques études ont abordé les effets de l’IRE sur la croissance tumorale dans d’autres types de tumeur, mais aucun n’ont porté sur PC. Nous avons développé un modèle de souris syngénique de PC dans lequel sous-cutanée (SQ) et l’orthotopic tumeurs peuvent être traités avec succès avec IRE dans un milieu hautement contrôlé, facilitant les diverses études longitudinales post procédure. Ce modèle animal constitue un système robuste pour étudier les effets de l’IRE et les moyens d’améliorer l’efficacité clinique de l’IRE.
Introduction
Adénocarcinome canalaire pancréatique (PC) devrait pour devenir la deuxième cause de décès par cancer aux Etats-Unis autour de 2020,1. La grande majorité des patients diagnostiqués avec PC finira par mourir de maladie métastatique lointain2. Le microenvironnement de la PC est notoirement immunosuppresseur et CHIMIOMORESISTANT. Son stroma desmoplastique contient une rareté des lymphocytes T effecteurs (anti-tumor) et une proéminence des leucocytes immunosuppresseurs, y compris les macrophages associées à la tumeur (EAPV), (MDSCs) des cellules myéloïde suppresseur dérivée et regulatory T cells (Tregs)3 . Elles sous-tendent la nécessité d’élaborer des stratégies multimodales qui contrebalancent ces effets du microenvironnement.
IRE a été conçu comme une méthode non thermiques de l’ablation de la tumeur. Contrairement aux techniques d’ablation thermique, IRE ne provoque pas de nécrose coagulantes rapide mais au contraire se traduit par apoptose progressive de mort cellulaire4. Ce qui est important pour les tumeurs du pancréas, IRE n’est pas vulnérable aux effets de « radiateur » et peut être effectuée juste à côté de vaisseaux sanguins5. Cette technologie a l’autorisation 510 (k) de la FDA6 et est actuellement utilisée sur le plan clinique, pour des patients sélectionnés localement avancé ou borderline résécables cancer du pancréas. Dans la plus grande série publiée d’IRE pour PC7, la survie médiane des patients subissant une IRE était environ double la survie des patients traités par chimiothérapie moderne seule sans résection8,9.
Plusieurs études ont démontré que l’ablation thermique induit une réponse immunitaire systémique dans d’autres types de tumeur (examinées par Chu et al. 10).11,12, y compris une augmentation dans les cellules activées tueuses naturelles (NK) de patients du cancer hépatocellulaire13, infiltre l’ablation par radiofréquence (RFA) dans la tumeur animaux modèles conduit à une augmentation des lymphocytes T 14et une diminution des Tregs immunosuppresseurs dans le poumon cancer patients15. Un nombre beaucoup plus restreint d’études ont examiné immunitaire, micro-environnementales et les réponses de la blessure à IRE16. IRE a été montré pour stimuler une réponse immunitaire systémique dans les modèles de souris immunocompétentes dans lequel la croissance des allogreffes de cellules rénales (controlatéral) secondaire a été réduite ou empêchée par IRE d’une tumeur primaire deux semaines plus tôt17. Ils ont également observé que les souris immunocompétentes exigeait moins de tension pour une régression complète que ne souris immunodéprimées. Il a émis l’hypothèse que IRE peut entraîner dans la présentation des antigènes améliorée par rapport à la nécrose coagulantes d’ablation thermique, mais cela n’a pas été spécifiquement étudiée.
Nous avons développé un modèle de souris syngénique du PC de la lignée cellulaire de KPC-Luc 4580 (cadeau de J.J. Yeh à l’Université de Caroline du Nord), qui a été dérivé d’une tumeur qui a mis au point dans un mâle LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + souris, pour étudier les effets les et systémiques de l’IRE18,19. Cette lignée de cellules exprimant luciférase est immunogène et aussi tumorigène chez les souris C57BL/6 immunocompétents lorsque injecté SQ ou orthotopically et fiable produit des métastases hépatiques lorsqu’elle est injectée dans la rate. Nous avons utilisé un générateur d’impulsions programmable onde carrée pour fournir 100 µs impulsions électriques dans un rapport de tension/distance de 1 500 V/cm à l’aide d’une sonde deux-aiguille (séparés par 5 mm) ou platine brucelles-trodes aux tumeurs SQ ou orthotopique, respectivement, en souris pour modéliser les effets de la IRE dans un petit animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons démontré un modèle de souris immunocompétentes pour PC qui peut être utilisé pour étudier les effets de l’IRE sur la croissance de la tumeur. Actuellement, IRE est utilisé comme une technique d’ablation non-thermique uniquement chez les patients de PC localement avancés hautement sélectionnés qui n’ont pas de progression de la maladie lointain après des mois de thérapie préopératoire. Son utilisation a donc été limitée car la plupart des patients avec PC localement av…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RRW a reçu le soutien pour ce travail d’une subvention de recherche concertée translationnelle financés par la pédale de Padres de San Diego C3 la Cause (#PTC2017).
Materials
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
Referências
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Howlader, N., et al. . SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013. , (1975).
- Clark, C. E., et al. Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion. Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).
- Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation. Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).
- Charpentier, K. P. Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet?. Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).
- Narayanan, G. Irreversible Electroporation. Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).
- Martin, R. C. Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy. Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).
- Belfiore, M. P., et al. Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience. Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).
- Belfiore, G., et al. Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer. Med Oncol. 34 (3), 38 (2017).
- Chu, K. F., Dupuy, D. E. Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy. Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).
- Wissniowski, T. T., et al. Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits. Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).
- Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma. Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).
- Zerbini, A., et al. Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response. Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).
- Ali, M. Y., et al. Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).
- Fietta, A. M., et al. Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer. Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).
- Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy. IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).
- Neal, R. E., et al. Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice. PLoS One. 8 (5), e64559 (2013).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).
- Safran, M., et al. Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination. Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).
- Martin, R. C., McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival. Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).
- Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).
