Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis
Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.
Abstract
De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het maag-darmkanaal door het genereren van tolerant reacties op dieet antigenen en commensale bacteriën terwijl montage effectieve immuun reacties op enteropathogenic microben. Bovendien is het duidelijk dat lokale intestinale immuniteit een diepgaande invloed op immuniteit van verre en systemische heeft geworden. Daarom is het belangrijk om te bestuderen hoe een intestinale immuunrespons wordt geïnduceerd en wat de immunologische uitkomst van de reactie is. Hier, een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van dunne darm inductieve sites zoals de gut-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren en effector sites zoals de lamina propria wordt beschreven en de intestinale epitheel. Deze techniek zorgt voor isolatie van een groot aantal lymfocyten van kleine intestinale weefsels met optimale zuiverheid en levensvatbaarheid en minimale compartimentaire kruisbesmetting binnen acceptabele tijdsbeperkingen. De technische mogelijkheden om te isoleren van lymfocyten en andere immune cellen van intestinale weefsels kan het begrip van immuunresponsen gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten.
Introduction
Het maag-darmkanaal (GI) heeft vele plooien en uitsteeksels die vertegenwoordigt de grootste interface scheiden van het interne lichaam en de externe omgeving. De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het GI-darmkanaal. Het is voortdurend blootgesteld aan dieet antigenen, commensale bacteriën en pathogene microben. Zo moet het verdraagzaam aan voedsel antigenen en commensale bacteriën blijven met behoud van het vermogen om snel genereren een effectieve immuunrespons op enteropathogenic microben1. De intestinale immuunsysteem kan anatomisch worden onderverdeeld in inductieve sites, waar naïef lymfocyten worden geactiveerd door antigeen presentatie van cellen dragen antigenen van de intestinale mucosa, en effector, waar de geactiveerde lymfocyten specifieke uitoefenen Effector functies2. De inductieve sites omvatten de georganiseerde lymfoïde structuur van Peyer van patches (PP) die enquêtes de intestinale lumen rechtstreeks via het optreden van gespecialiseerde cellen van de M en de regionale zuig mesenterische lymfklieren (MILJ.). De effector sites bestaan uit de lamina propria (LP), oftewel het bindweefsel onder de kelder-membraan en het intestinaal epitheel, een eencellige laag gelegen boven de kelder membraan dat geest lymfocyten (IEL) bevat. Lymfocyten zijn belangrijke spelers van adaptieve immuniteit die bemiddelen bescherming tegen infecties en kanker en kunnen ook bijdragen aan Immunopathologie in ontstekingsziekten. Het is belangrijk en zeer relevant voor de studie van lymfocyten in deze verschillende anatomische mucosal compartimenten beter begrijpen hun inductie en effector functies.
Een relatief eenvoudige en uniforme protocol voor de isolatie van lymfocyten van deze compartimenten is nodig omdat het aantal onderzoekers het verkennen van immuun gebeurtenissen die zich in de darm zijn versnellen. Verschillende onderzoeksgroepen hebben gepubliceerd protocollen die delen van verschillende soortgelijke processen voor het isoleren van immuuncellen van de muis kleine intestinale compartimenten3,4,5,6,7 . Er zijn echter verschillende technische onderling verschillen afhankelijk van de focus van het individuele protocol. Bijvoorbeeld, met de focus op het isoleren van immuuncellen van de LP, onderzoekt één protocol de impact van verschillende enzymatische spijsvertering op de levensvatbaarheid van de cellen, cel-oppervlakte marker expressie en de samenstelling van geïsoleerde immuuncellen5. Een ander protocol wijst op een snelle en reproduceerbare methode voor isolatie van lymfocyten zonder dichtheid centrifugeren6. Tot slot, specifieke protocollen bestaan ook met het oog op het isoleren van mononucleaire fagocyten uit weefsel van de verschillende lagen van de dunne darm7. Hier, wordt een zeer reproduceerbaar protocol waarmee sequentiële Isolatievan lymfocyt populaties van de MLN, PP, LP en IEL compartiment van de dunne darm gepresenteerd.
Wij focussen op het isoleren van hoogst gezuiverde populaties van de LP en IEL compartimenten, die grotendeels vrij is van contaminanten in andere intestinale compartimenten. Dit gebruikte protocol produceert een hoog rendement van maximaal zuiver en levensvatbare lymfocyten binnen acceptabele tijd beperkingen4,8,9,10,11,12. Dit protocol zorgt er ook voor de isolatie van lymfocyten van de LP en IEL compartiment met minimale compartimentaire kruisbesmetting, waardoor een bonafide mogelijkheid om te studeren van lymfocyten in deze afzonderlijke compartimenten. De geïsoleerde lymfocyten kunnen worden onderworpen aan verdere manipulaties zoals flow cytometrische analyse of functionele analyse. Dit protocol is met succes toegepast, tot de isolering van lymfocyten uit de muis dunne darm en dikke darm tijdens bacteriële infecties zoals Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumpt Yersinia pseudotuberculosis infecties en inflammatoire aandoeningen zoals chemische – en pathogen-geïnduceerde colitis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te isoleren van de ingeboren immune cellen zoals dendritische cellen, macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten van de muis dunne darm en dikke darm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van lymfocyten van de intestinale mucosa inductieve (MLN en PP) en effector (LP en IEL compartiment) sites. Het protocol is ontwikkeld om het evenwicht van de input (keer) en output (levensvatbaarheid en rendement) naar maximalisering van productiviteit en resultaten. Het protocol zorgt er ook voor minimale compartimentaire kruisbesmetting tussen LP en IEL compartimenten.
Verschillende protocollen voor de isolatie van immuun celle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. wordt ondersteund door NIH grant (R01 AI076457) en fondsen geboden door Stony Brook University. Z.Q. wordt ondersteund door de NIH verlenen (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
Referências
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
