Summary

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

Published: May 07, 2018
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Summary

Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.

Abstract

Glândula salivar submandibular (SMG) é uma das três principais glândulas salivares e é de interesse para muitos diferentes campos de pesquisa biológica, incluindo Imunologia, oncologia, odontologia e biologia celular. O SMG é uma glândula exócrina composta de células epiteliais secretoras, miofibroblastos, células endoteliais, nervos e matriz extracelular. Processos celulares dinâmicos no rato e rato SMG anteriormente tem sido fotografados, principalmente utilizando invertido sistemas multi fóton microscópio. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a preparação cirúrgica e estabilização da SMG murino em ratos anestesiados para a imagem latente na vivo com sistemas vertical multi fóton microscópio. Apresentamos a moda imagem intravital representativa de endógena e enviaram transferido células fluorescentes, incluindo a rotulagem dos vasos sanguíneos ou dutos salivares e geração segundo harmônica Visualizar fibrillar colágeno. Em suma, nosso protocolo permite a preparação cirúrgica das glândulas salivares de rato em sistemas de microscopia na posição vertical, que são comumente usados para intravital imagem no campo da imunologia.

Introduction

Saliva é secretada pelas glândulas exócrinas para lubrificar o alimento, proteger as superfícies mucosas do trato oral e entregar as enzimas digestivas, bem como substâncias antimicrobianas1,2. Além de glândulas salivares menores intercaladas na submucosa oral, existem três conjuntos bilaterais das glândulas maiores identificados como parótida, sublingual e submandibular, de acordo com sua localização1,2. Células epiteliais em forma de pirâmide, organizados em sacos em forma de balão (ácinos) ou demilunes que são circundadas por células mioepiteliais e uma membrana basal, secretam os componentes seroso e mucosos de saliva1. O estreito espaço luminal dos ácinos drenos para dutos intercalados, que se unem para dutos estriados até que eles finalmente se juntam em um único Ducto excretor1. O Ducto excretor principal da SMG é chamado ducto de Wharton (WD) e abre para a carúncula sublingual3,4. O compartimento de epiteliais SMG representa, portanto, uma estrutura altamente arborized com múltiplos pontos de extremidade do terminais, assemelhando-se a um pacote de uvas1,5,6. O interstício SMG é composto de vasos sanguínea e linfática, incorporados no tecido conjuntivo7 que contém nervos parassimpáticos8 e matriz extracelular5. Glândulas salivares normais de humanas e roedores também contêm células T, macrófagos e células dendríticas9, bem como plasmócitos que secretam a imunoglobulina A (IgA) na saliva9,10. Devido a suas funções multifacetadas na saúde e na doença, a SMG é um assunto de interesse para muitos campos de pesquisa biológica, incluindo Odontologia4Imunologia11, oncologia12, fisiologia8e biologia celular 3.

Imagem de interações e processos celulares dinâmicos é uma ferramenta poderosa em pesquisas biológicas13,14. O desenvolvimento do tecido profundo imaging e inovações inmicroscopes baseado em óptica não-linear (NLO), que contam com dispersão ou absorção de múltiplos fótons pela amostra, permitiu-se diretamente, examinar processos celulares em tecidos complexos13 ,15. Absorção de múltiplos fótons envolve a entrega da energia total excitação por fótons de baixa energia, que excitação de fluoróforo limites para o plano focal e, portanto, permite a penetração mais profunda do tecido com Fotodano reduzido e ruído fora do foco excitação de13,15. Este princípio é empregado pela microscopia de dois fotões (14:00) e permite que para a imagem latente de amostras fluorescentes em profundidades de até 1 mm15,16. Enquanto comercialmente disponível 14:00 configurações tornaram-se amigável e confiável, o grande desafio para a imagem latente intravital é cuidadosamente expor e estabilizar o órgão-alvo de ratos anestesiados, especialmente para a imagem latente da série de lapso de tempo. Vários métodos para a correção de deriva digital depois de aquisição de dados ter sido publicado17,18 anos e recentemente desenvolvemos a “VivoFollow”, um sistema de correção automática, que neutraliza o tecido lenta deriva em tempo real usando um estágio informatizado19. No entanto, é ainda essencial para alta qualidade de imagem para minimizar o movimento do tecido, especialmente movimentos rápidos causados pela respiração ou batimento cardíaco19. Procedimentos de preparação e estabilização foram publicados por vários órgãos, incluindo medula espinhal2021de fígado, pele22, pulmão23e linfonodo24. Além disso, modelos para a imagem latente de glândulas salivares de ratos foram desenvolvidos3,25 e ainda mais refinado para intravital imagem de alta resolução do murino que SMG adaptado a um microscópio invertido configuração26, 27 , 28.

Aqui, apresentamos um protocolo prático e adaptável para intravital imagem da SMG murino utilizando microscopia não linear vertical, que é comumente usada para a imagem latente intravital no campo da imunologia. Para este fim, nós modificamos um palco de imobilização muito utilizado usado para preparações de linfonodo poplíteo.

Protocol

Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comité Cantonal de Experimentação Animal e realizado de acordo com as diretrizes federais. 1. anestesiar o Mouse Utilize equipamento de protecção pessoal, incluindo luvas e jaleco. Misture cetamina, xilazina e soro fisiológico para um trabalho de concentração de 20 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente. Injetar o estoque de trabalho intraperitonealmente (i.p.) em 8-10 µ l/g de rato. Coloque o mouse volta para a jaula.Nota: Es…

Representative Results

Este protocolo permite imagens de quase todo o dorsal ou ventral lado da SMG. O campo de visão tipicamente inclui também a glândula salivar sublingual, que difere ligeiramente da SMG na composição celular4. Ambas as glândulas são encapsuladas por colágeno fibrillar e subdivididas em lóbulos. A maioria das 14:00 sistemas podem produzir uma imagem livre de rótulo de colágeno fibrillar medindo o sinal harmônico 2nd , mas geralmente moléculas fl…

Discussion

Este protocolo oferece uma abordagem simples para a imagem latente na vivo de murino glândulas salivares submandibulares e sublingual usando microscopia não-linear vertical, muitas vezes usada no campo da imunologia. O método pode ser adaptado para o tratamento de imagens de outras glândulas exócrinas na região da cabeça e pescoço. Por exemplo, nosso laboratório tem realizado de imagem da glândula lacrimal de forma análoga (não mostrada).

Remover o tecido conectivo ao redo…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional Suíço (SNF) projeto concessão 31003A_135649, 31003A_153457 e 31003A_172994 (para joint ventures) e Leopoldina companheirismo semi-submersíveis 2011-16 (a BS). Este trabalho beneficiado ópticas configurações do “Microscopia Imaging Center” (MIC) da Universidade de Berna.

Materials

Narketan 10 %  (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) Vetoquinol 3605877535982
Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) Bayer 680538150144
Saline NaCl 0.9% B. Braun 3535789
Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) Fatro 6805671900029
Electric shaver Wahl 9818L or similar
Hair removal cream Veet 4002448090656
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-1
Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) Durapore (3M) 1538-0
Super glue Ultra gel, instantaneous glue Pattex, Henkel 4015000415040
Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm Menzel-Gläser 631-1343/ 631-1344
Grease for laboratories 60 g glisseal N Borer (VWR supplier) DECO514215.00-CA15
Surgical scissors Fine Science Tools (F.S.T ) 14090-09 or similar
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T ) 11252-20 or similar
Cotton swab Migros 617027988254 or similar
Gauze Gazin 5 x 5 cm Lohmann and Rauscher 18500 or similar
Stereomicroscope Leica MZ16 or similar
Texas Red dextran 70kDa  Molecular Probes D1864
Cascade Blue dextran 10kDa invitrogen D1976
Two-photon system LaVision Biotec TrimScope I and II or similar
XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective Olympus n/a or other water immersion objective 
Digital thermometer Fluke 95969077651

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Ficht, X., Thelen, F., Stolp, B., Stein, J. V. Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (135), e57283, doi:10.3791/57283 (2018).

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