I denne studien, vi beskriver en metode for å analysere C924T genotype. Protokollen består av tre faser: DNA utvinning, forsterkning av polymerasekjedereaksjons (PCR) og analyse av begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) på agarose gel.
Thromboxane A2 reseptor (TBXA2R) genet er medlem av G-protein kombinert gruppe med sju-transmembrane regioner. Det er involvert i atherogenesis progresjon, iskemi og hjerteinfarkt. Her presenterer vi en metode for pasienten genotyperingteknologi å undersøke post-transcriptional rollen som C924T polymorfisme (rs4523) ligger i regionen 3 av TBXA2 reseptor genet. Denne metoden er avhengig av DNA utvinning fra fullblod, polymerase kjedereaksjon (PCR) forsterkning av TBXA2 genet delen inneholder C924T mutasjon, og identifikasjon av vill-type og/eller mutant genotyper bruker en begrensning digest analyse, spesielt en begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) på agarose gel. I tillegg ble resultatene bekreftet av sekvensering TBXA2R genet. Denne metoden har flere potensielle fordeler, for eksempel høy effektivitet og rask identifisering av C924T polymorfisme av PCR og begrensning enzym. Denne tilnærmingen kan en prediktiv studie for plakk formasjon og aterosklerose progresjon ved å analysere pasienten genotyper for TBXA2R C924T polymorfisme. Anvendelsen av denne metoden har potensial til å identifisere emner som er mer utsatt for aterotrombotiske prosesser i fagene i en høy-risiko, aspirin-behandlet gruppe.
TBXA2R er medlem av G-protein kombinert gruppe med sju-transmembrane regioner, som er uttrykt og lokalisert på cellemembraner eller på intracellulær strukturer1,2. TBXA2R signalveien er involvert i avansert aterosklerotisk prosesser3. Økt uttrykk for TBXA2 reseptoren var vist under atherogenesis progresjon, og kliniske og eksperimentelle studier viste sin relevante rolle i iskemi og hjerteinfarkt4. C924T, en single nukleotid polymorfisme (SNP) av TBXA2R genet, ble anerkjent som en funksjonell polymorfisme hos friske frivillige, og har vært knyttet til kliniske lidelser5. Videre vist våre tidligere studie6 at C924T polymorfisme av TBXA2R genet er involvert i transkripsjon stabilitet; det oppstår en øket ustabilitet av mutant (TT) type transkripsjon forhold til wild type (CC). I tillegg indusert flere stimuli som adenosindifosfat (ADP), adrenalin og kollagen i ulike konsentrasjoner trombocyttaggregasjon mindre effektiv for den muterte (TT). Dette er i tråd med redusert dannelse og hemostasen. Dermed kan ustabilitet i TBXA2R transkripsjon og tilknyttede reduksjon av trombocyttaggregasjon være assosiert med en beskyttende rolle for TBXA2R TT genotype mot atherothrombosis og dens komplikasjoner i høyrisikoatferd aspirin-behandlede pasienter6 .
Her beskriver vi en metode for pasienten genotyperingteknologi å undersøke post-transcriptional rollen som C924T polymorfisme (rs4523) ligger i regionen 3 av TBXA2 reseptor genet. Denne metoden er avhengig av følgende: (1) DNA utvinning fra fullblod, (2) PCR forsterkning av TBXA2R genet delen inneholder C924T mutasjon, og (3) identifikasjon av vill-type og/eller mutant genotyper bruker begrensningen fragment lengde polymorfisme (RFLP) på agarose gel. RFLP er en teknikk som utnytter variasjoner i homologe DNA-sekvenser7. Dette programmet ble brukt til å oppdage DNA polymorfismer, spesielt SNPs, og for å finne og knytte biologiske relevans i genetisk variasjoner8. Polymorfisme analysert for første gang ved hjelp av RFLP-PCR hos mennesker var ABO blod9. Metoden RFLP PCR tillater analyse av genetiske mutasjoner i homologe DNA-sekvenser ved å evaluere tilstedeværelsen av fragmenter av ulike lengder etter DNA fordøyelsen bruker svært spesifikke begrensning endonucleases10.
I tidligere år har de følgende metodikkene har vært benyttet for SNP analyse ved hjelp av PCR teknikk: hybridisering kort allel-spesifikke oligonucleotides11, allel-spesifikke PCR12, primer forlengelse på DNA microarrays13, oligonucleotide ligation analysen14, direkte DNA sekvensering for identifiserende posisjon-spesifikke enkelt-nukleotid polymorfismer15, Taqman metoden16, utvinning Matrix-Assisted Laser desorpsjon/ionisering Time Of Flight ( MALDI-TOF) massespektrometri17, og GeneChips18. Disse teknikkene er ikke enkel å bruke og krever dyrt utstyr. Derimot metoden PCR-RFLP er rimelig, enkel å bruke, praktisk, har en høy effektivitet, og tillater rask identifisering av C924T polymorfisme. I tillegg har vi bekreftet resultatene av sekvensering TBXA2R genet bruker Sanger metoden15.
Denne tilnærmingen kan en prediktiv studie av plakk dannes og aterosklerose progresjon ved å analysere pasienten genotyper for TBXA2R C924T polymorfisme. Denne metoden kan identifisere fag mer utsatt for aterotrombotiske prosesser, spesielt de blant høyrisikoatferd, aspirin-behandlede pasienter.
I studien, har vi beskrev en metode som tillater pasientens genotyperingteknologi for å undersøke post-transcriptional rollen som C924T polymorfisme (rs4523) ligger i regionen 3 av TBXA2R genet. Først denne metoden er avhengig av DNA utvinning fra fullblod. Spesielt består denne første prosessen av en renselse av totale menneskelige DNA, genomisk og mitokondrie, fra hele blodprøver friske eller frosne, behandlet med EDTA (citrate eller heparin). For kort sikt lagring av hele blodprøver, lagre på 2-8 ° C for opp til 10 dager. For lagring lagre over 10 dager, prøver på-70 ° C. En automatisert renselsesprosess omfatter 4 trinn: lyse, binder, vaske og elute. Andre bruker metoden PCR forsterkning av TBXA2R genet delen inneholder C924T mutasjon. Til slutt, identifikasjon av vill type eller mutant genotype bruke en begrensning enzym analyse (RFLP) på agarose gel utføres.
Avgjørende skritt i protokollen er følgende: (i) i saken som en del av agarose gel lagret på RT brukes, befestet agarose kan være nytt oppløst over et kokende vann bad (på 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrobølgeovn (3-5 minutter) før strømme. Merk: løsne hetten da re smelter agarose i en flaske. (ii), videre når varme agarose, fordampning forårsaker en økning av konsentrasjonen. Derfor kan det være nyttig å kompensere ved å legge en liten mengde vann. (iii) DNA fragmenter av mindre enn 1000 bp var atskilte av agarose gel, og TBE buffer anbefales å få best mulig separasjon. (iv) vi foretrekker å bruke en agarose gel i stedet for en polyakrylamid gel fordi utarbeidelse av sistnevnte er mer vanskelig, og det tar mye lengre tid å sette opp. (v) valg av kjøretiden til gel geleelektroforese er avhengig av den forventede størrelsen av forsterkning produktene. Basert på denne protokollen, er det tilstrekkelig å utføre en geleelektroforese i 20-30 min 100 V i 2% agarose gel, siden størrelsen på PCR fragmenter spenner fra 100-500 bp. (vi) er det obligatorisk å få 10 til 50 ng av en god mal DNA utdraget fra menneskelige prøver . Derfor foretrekker vi å bruke en automatisert DNA-rensing i stedet for en semi-automatisk eller manuell. (vii) forberede master-mix reaksjonen for PCR forsterkning og master-mix løsningen for PCR produkter fordøyelsen, å legge 10% mer (å konto for tap av væske under pipettering) volumet beregnes multiplisert med antall utdrag for volumet kreves for en DNA-prøve.
Den vanligste fallgruven metoden er ekstra forsterkning produkter på grunn av en feil termisk cycler program, en feil forsterkning master-blanding forberedelse eller en DNA mal forurensning. Videre kan fravær av PCR produkter være grunn deaktivert Taq utvalg eller et feil termisk cycler kjøre. I tillegg kan tilstedeværelsen av uventet fragmenter være PCR kontaminering av produktet eller en ufullstendig fordøyelsen fra et deaktivert enzym, for lite mengden begrensning enzym volum eller gangen for kort inkubasjon.
I de siste årene har de følgende metodikkene har vært benyttet for SNP analyse ved hjelp av PCR teknikk: hybridisering kort allel-spesifikke oligonucleotides11, allel-spesifikke PCR12, primer forlengelse på DNA microarrays13 , oligonucleotide ligation analysen14, direkte DNA sekvensering identifisere posisjon-spesifikke enkelt-nukleotid polymorfismer15, Taqman metoden16, utvinning Matrix-Assisted Laser desorpsjon/ionisering Tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri17, og GeneChips18. Disse metodene er ikke ideelt fordi de ikke er enkelt å bruke og/eller krever dyrt utstyr. Derimot PCR-RFLP metoden beskrevet i denne studien er rimelig, enkel å bruke, praktisk, har en høy effektivitet, og tillater rask identifisering av C924T polymorfisme. En begrensning til stede metoden er at det kan bare brukes for et lite antall SNPs og noen eksempler i en arbeidsøkt.
For framtidige applikasjoner, kan denne metoden brukes for prediktiv studier om plakk formasjon og aterosklerose progresjon ved å analysere de pasient genotyper for TBXA2R C924T polymorfisme. Videre denne metoden kunne identifisere fag mer utsatt for aterotrombotiske prosesser, spesielt høy risiko pasienter behandlet med aspirin. Til slutt denne metoden kan brukes for å studere andre polymorfismer involvert i personlig medisin for bestemte stoffer (for eksempel antikoagulanter og antiepileptika) for å forstå den aktuelle narkotika doseringen og enkelt farmakologiske og klinisk respons for hver pasient før du begynner terapi og for å unngå bivirkninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble delvis finansiert av 60% Ateneo tilskudd fra Ministero dell’Università, Italia S.M. og E.T. Vi har også fått delvis bidrag til forskning utgifter av Institutt for medisinsk, Oral og bioteknologisk vitenskap, Universitetet i Chieti “G. d’Annunzio”.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |