使用 pBIBAC 的二进制向量, 可以生成具有完整单拷贝插入的转基因植物, 这是一个简单的过程。在这里, 提出了一系列的协议, 指导读者通过生成转基因拟南芥植物的过程, 并测试植物的完整性和复制数量的插入。
在生成转基因植物时, 一般的目的是要有稳定的转基因表达。这需要一个单一的, 完整的整合的转基因, 因为多拷贝集成往往受到基因沉默。与其他 pBIBAC 衍生物一样, 基于细菌人工染色体 (pBIBAC) 的网关兼容二进制向量允许单拷贝转基因的高效插入。作为对原 pBIBAC 的改进, 一个网关盒已被克隆成 pBIBAC, 因此, 现在的兴趣序列可以很容易地纳入矢量转移 dna (T DNA) 的网关克隆。通常情况下, 与 pBIBAC 的转换结果是0.2–0.5% 的效率, 即转基因的一半携带完整的单拷贝集成的 T DNA。pBIBAC 的载体是可利用的抗膦铵或 DsRed 荧光的种子大衣, 以选择在植物, 和抗卡那霉素作为选择的细菌。在这里, 提出了一系列的协议, 引导读者通过使用 pBIBAC 生成转基因植物的过程: 从将兴趣序列重新结合到 pBIBAC 的选择向量, 到植物转化与农杆菌, 选择转基因, 并测试植物的完整性和复制数量的插入使用 DNA 印迹。注意设计一种 DNA 印迹策略, 以识别单个和多个位点的单拷贝和多复制集成。
在生成转基因植物时, 通常的目的是使综合转基因 (s) 稳定表达。这可以通过转基因的完整的单拷贝集成来实现。多重整合可以导致基因表达的增加, 同时也会使转基因沉默。如果插入的序列排列在串联或反转重复的1、2、3、4中,则更有可能转基因沉默。在农杆菌介导的转化实验中, 二进制向量被用作航天飞机, 将感兴趣的序列传递到植物基因组中。集成到植物基因组的数量依赖于农杆菌5、6中二进制向量的拷贝号.许多常用的二进制向量都是高拷贝向量, 因此产生高平均的转基因拷贝数:拟南芥5中的3.3 到4.9 个拷贝。
通过使用.BIBAC 中具有低拷贝数的二进制向量 (如7) 或从a. 农杆菌染色体5启动 t dna, 可以降低 t dna 积分的数量。在这种情况下, 转基因集成的平均数量低于 25,8,9,10。由于在A. 农杆菌和大肠杆菌中都是单拷贝, BIBAC 衍生物可以维护和交付 150 kb11大的构造。
与 GW 兼容的 BIBAC 矢量10,12允许使用网关克隆轻松地将感兴趣的基因引入到向量中。网关技术的使用大大简化了克隆过程, 也克服了与大型低拷贝数向量13、14相关的常见问题, 如低 DNA 产量和有限的独特限制选择。可用于克隆7、11的站点。在植物 (图 1)10,12中, pBIBAC 的衍生物可在种子大衣 (pBIBAC-RFP) 中对膦铵 (pBIBAC 棒) 或 DsRed 荧光进行抗性。对于这两种载体, 卡那霉素抗性基因被用作细菌的选择标记。
pBIBAC 的向量结合: (1) 易于设计和遗传操作在大肠杆菌和 (2) 完整的单拷贝集成在 planta高效率。在拟南芥中, pBIBAC 的向量平均1.7 积分, 其中大约一半的转基因植株携带着单个集成的 T 型 DNA10。
转基因的稳定表达是大多数转基因产生的必要条件。稳定的转基因表达可以通过完整的单拷贝集成实现。然而, 与转基因植物进行完整的, 单拷贝集成是更重要的, 如果例如, 目的是研究的效率, 染色质的过程, 如诱变, 重组, 或修复, 并依赖这些在插入部位的基因组位置和染色质结构的过程。为了我们的兴趣, 研究寡核苷酸定向诱变 (ODM) 对局部基因组上下文的依赖性, 生成了一组完整的、单拷贝的突变报告基因集成的报告 (图 2)10。使用这组线, 结果表明, 在不同基因组位置集成的转基因基因座的 ODM 效率不同, 尽管转基因表达水平相当相似。
对产生转基因的关键是单一的, 完整的整合的转基因是使用二进制向量的选择。BIBAC 家族载体已被用来交付许多植物物种的利益序列23,24,25,26,27,28。BIBAC 向量, 包括 BIBAC, 具有高效率的单拷贝集成: 每行插入的平均数量是1.5 到 2, 而最常用的二进制向量…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到荷兰技术基金会 STW (12385) 的支持, 该基金是荷兰科学研究组织 (NWO) 的一部分, 由经济事务部 (检察官办公室赠款12385至 MS) 部分资助。 我们感谢卡罗尔 m. 汉密尔顿 (美国康奈尔大学) 提供 pCH20, BIBAC 的主干。
Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Bacto tryptone | BD | 211705 | |
Yeast extract | BD | 212750 | |
Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
Agar | BD | 214010 | |
Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
Restriction enzymes | NEB | ||
Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
Boric acid | Merck | 100165 | |
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
Heat sealer | |||
Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |