Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW
Summary
Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.
Abstract
Bij het genereren van transgene planten, in het algemeen is het doel is om stabiele uitdrukking van een transgenic. Dit vereist een enkele, intact integratie van de transgenic, zoals multicopy integraties vaak aan gene zwijgen onderworpen zijn. De Gateway-compatibele binaire vector gebaseerd op bacteriële kunstmatige chromosomen (pBIBAC-GW), zoals andere derivaten van pBIBAC, kan het inbrengen van single-kopie transgenen met een hoog rendement. Als een verbetering van de oorspronkelijke pBIBAC, heeft een Gateway-cassette gekloond in pBIBAC-GW, zodat de sequenties van belang nu worden gemakkelijk in de overdracht van de vector DNA (T-DNA) door Gateway klonen opgenomen kunnen. Algemeen, de transformatie met pBIBAC-GW leidt tot een efficiëntie van 0,2 – 0,5%, waarbij de helft van de transgenics dragen een intact integratie van de enkel-kopie van T-DNA. De pBIBAC-GW vectoren zijn beschikbaar met weerstand tegen glufosinaatammonium of DsRed fluorescentie in zaad jassen voor selectie in planten en weerstand tegen kanamycine als een selectie in bacteriën. Hier, een reeks van protocollen die de lezer door het proces leiden van het genereren van transgene planten met behulp van pBIBAC-GW is gepresenteerd: vanaf samenvoegen van de sequenties van belang in de pBIBAC-GW vector van keuze, te planten transformatie met Agrobacterium, selectie van de transgenics, en het testen van de planten naar INTACTHEID en kopie van de tussenvoegsels gebruikend DNA bevlekken. Aandacht besteed aan het ontwerpen van een strategie voor het Bevlekkende van DNA om te herkennen van single – en multi – kopie integraties op enkelvoudige en meervoudige loci.
Introduction
Bij het genereren van transgene planten, meestal is het doel is om de geïntegreerde transgene(s) stabiel uitgedrukt. Dit kan worden bereikt door intact één exemplaar integraties van een transgenic. Meerdere integraties kunnen leiden tot verhoogde uitdrukking van een transgenic, maar ook gene zwijgen. Zwijgen van transgenen is meer waarschijnlijk als ingevoegde sequenties zijn gerangschikt in tandem of omgekeerde herhalingen1,,2,,3,4. Binaire vectoren worden gebruikt als shuttles in Agrobacterium-gemedieerde transformatie experimenten te leveren van de sequenties van belang in bedrijf genomen. Het aantal integraties in het genoom van een plant is afhankelijk van het exemplaaraantal van de binaire vector in Agrobacterium tumefaciens5,6. Veel gebruikte binaire vectoren zijn hoge kopiëren vectoren, en daarom een hoge gemiddelde transgenic exemplaaraantal opleveren: 3.3 tot en met 4.9 exemplaren in Arabidopsis5.
Het aantal T-DNA integraties kan worden verlaagd met behulp van binaire vectoren hebben een lage exemplaaraantal in A. tumefaciens, zoals BIBAC7, of door de lancering van een T-DNA van de A. tumefaciens chromosoom5. Het gemiddelde aantal transgenic integraties in dergelijke gevallen lager is dan 25,–8,–9,10. Te wijten aan één-kopie in A. tumefaciens, en ook in Escherichia coli, BIBAC-derivaten kunnen onderhouden en leveren van constructies zo groot als 150 kb11.
GW-compatibele BIBAC vectoren10,12 kunnen gemakkelijk binnenbrengen van genen van belang: de vector met Gateway klonen. Het gebruik van Gateway technologie vereenvoudigt de klonen procedure, maar overwint ook gemeenschappelijke problemen in verband met grote lage exemplaaraantal vectoren13,14, zoals een lage opbrengst van DNA en een beperkte selectie van unieke beperking sites beschikbaar voor het klonen van de7,11. De pBIBAC-GW-derivaten zijn beschikbaar met hetzij weerstand tegen glufosinaatammonium (pBIBAC-BAR-GW) of DsRed fluorescentie in zaad jassen (pBIBAC-RFP-GW) voor selectie in planten (Figuur 1)10,12. Voor beide vectoren, wordt een kanamycine resistentie gen gebruikt als de markering van selectie bij bacteriën.
De pBIBAC-GW vectoren combineren: (1) gemakkelijk design en genetische manipulatie in E. coli, en (2) intact single-kopie integraties in planta op hoog rendement. Het rendement van de vectoren pBIBAC-GW op gemiddeld 1,7 integraties in Arabidopsis met ongeveer de helft van de transgene planten dragen een honkslag geïntegreerd T-DNA10.
Stabiele uitdrukking van transgenen is een vereiste voor de meeste transgenics gegenereerd. Stabiele transgenic expressie kan worden bereikt door intact, single-kopie integraties. Werken met transgene planten intact, single-kopie integraties uitvoering is echter nog belangrijker als bijvoorbeeld het doel is om de efficiëntie van chromatine gebaseerde processen, zoals mutagenese, recombinatie, of reparatie en de afhankelijkheid van deze studie processen op de genomic locatie en de structuur van de chromatine op de site van de invoegpositie. Voor ons belang, om te bestuderen van de afhankelijkheid van oligonucleotide geregisseerd mutagenese (ODM) op de lokale genomic context, was een reeks van verslaggever lijnen met intact, single-kopie integraties van een gen mutagenese verslaggever gegenereerde (Figuur 2)10. Met deze set van regels, werd aangetoond dat de efficiëntie ODM varieert tussen transgene loci geïntegreerd op verschillende genomic locaties, ondanks de transgenic expressie niveaus vrij gelijkaardig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cruciaal belang voor het genereren van transgenics met enkele, intact integraties van een transgenic is de keuze van de binaire vector gebruikt. BIBAC familie vectoren zijn gebruikt om het leveren van sequenties van belangen aan veel plant soorten23,24,25,26,27,28. BIBAC vectoren, met inbegrip van BIBAC-GW, single-kopie integ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek wordt ondersteund door de Nederlandse technologie Stichting STW (12385), dat deel uitmaakt van de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO), en die is deels gefinancierd door het ministerie van economische zaken (OTP Grant 12385 aan MS). Wij danken Carol M. Hamilton (Cornell University, Verenigde Staten) voor het verstrekken van pCH20, de ruggengraat van de BIBAC-GW vectoren.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referências
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
