Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW
Summary
Mit einem pBIBAC-GW binären Vektor macht Erzeugung transgene Pflanzen mit intakten Single Copy Einfügungen, ein einfacher Vorgang. Hier präsentiert eine Reihe von Protokollen, die führen des Lesers durch den Prozess der Generierung von transgenen Pflanzen in Arabidopsis und Versuchsanlagen für Unversehrtheit und Anzahl der Einsätze zu kopieren.
Abstract
Beim Generieren von transgenen Pflanzen ist in der Regel das Ziel, stabile Expression ein Transgen zu haben. Dies erfordert eine einheitliche, intakte Integration des Transgens, Multi-Kopie-Integrationen häufig Gen-silencing ausgesetzt sind. Der Gateway-kompatiblen binären Vektor basierend auf bakterielle künstliche Chromosomen (pBIBAC-GW), wie andere pBIBAC-Derivate, ermöglicht das Einfügen von Single Copy transgene mit hohem Wirkungsgrad. Als eine Verbesserung der ursprünglichen pBIBAC hat eine Gateway-Kassette in pBIBAC-GW, geklont worden, so dass die Sequenzen von Interesse jetzt leicht in den Vektor Transfer DNA (T-DNA) durch Klonen Gateway integriert werden können. Die Transformation mit pBIBAC-GW wird häufig, einen Wirkungsgrad von 0,2 – 0,5 %, wobei die Hälfte der gentechnisch veränderten Pflanzen eine intakte Single Copy-Integration der T-DNA tragen. Die pBIBAC-GW-Vektoren sind mit Resistenz gegenüber Glufosinat-Ammonium oder DsRed Fluoreszenz in Samenhüllen in Pflanzen zur Auswahl und mit einer Resistenz gegen Kanamycin als Auswahl in Bakterien. Hier ist eine Reihe von Protokollen, die der Leser durch den Prozess der Erzeugung transgener Pflanzen mit pBIBAC-GW präsentiert: ausgehend von Rekombination die Sequenzen von Interesse in der pBIBAC-GW-Vektor der Wahl, um die Transformation mit Pflanzen Agrobacterium, Auswahl der gentechnisch veränderten Pflanzen und Versuchsanlagen für Unversehrtheit und Kopie Zahl der Einsätze mit DNA zu beflecken. Aufmerksamkeit gilt beim Entwerfen einer DNA-befleckenden Strategie, Single und copy Integrationen auf einzelne und mehrere Loci zu erkennen.
Introduction
Beim Generieren von transgenen Pflanzen ist in der Regel das Ziel, die integrierte transgene stabil ausgedrückt zu haben. Dies kann durch intakte Einzelkopie Integrationen von ein Transgen. Mehrfachintegrationen können zu erhöhten Ausdruck ein Transgen, sondern auch Gen-silencing führen. Der transgene Silencing ist wahrscheinlicher, wenn die eingefügte Sequenzen in Tandem- oder invertierte Wiederholungen1,2,3,4angeordnet sind. Binäre Vektoren dienen als Shuttles in Agrobakterium-vermittelten Umwandlung Experimente durchführen, um die Sequenzen von Interesse in Pflanzengenomen liefern. Die Zahl der Integrationen in ein pflanzliches Genom ist abhängig von der Kopienzahl des binären Vektor in Agrobacterium Tumefaciens5,6. Viele häufig verwendete binäre Vektoren sind hohe Kopie Vektoren, und daher ergeben eine hohe durchschnittliche Transgen Exemplarzahl: 3,3 bis 4,9 Kopien in Arabidopsis5.
Die Anzahl der T-DNA Integrationen kann mithilfe von binäre Vektoren, bei denen eine niedrige Kopienzahl in A. Tumefaciens, z. B. BIBAC7oder durch die Einführung einer T-DNS von A. Tumefaciens Chromosom5gesenkt werden. Die durchschnittliche Anzahl der Transgen-Integrationen in solchen Fällen liegt unter 25,8,9,10. Durch die Single Copy in A. Tumefaciens, und auch in Escherichia coli, BIBAC-Derivate erhalten und Konstrukte, die so groß wie 150 kb11liefern können.
GW-kompatible BIBAC Vektoren10,12 erlauben einfache Einführung von Genen von Interesse in den Vektor durch Gateway zu klonen. Die Verwendung von Gateway-Technologie vereinfacht das Klonen Verfahren, aber auch häufige Probleme im Zusammenhang mit großen niedrige Kopienzahl Vektoren13,14, wie eine geringe DNA-Ausbeute und eine begrenzte Auswahl an einzigartigen Beschränkung überwindet Standorte für das Klonen7,11. Die pBIBAC-GW-Derivate sind entweder Widerstand zu Glufosinat-Ammonium (pBIBAC-BAR-GW) oder DsRed Fluoreszenz in Samenhüllen (pBIBAC-RFP-GW) in Pflanzen (Abbildung 1)10,12zur Auswahl zur Verfügung. Für beide Vektoren ist eine Kanamycin-Resistenz-Gen als Selektionsmarker in Bakterien verwendet.
Kombinieren Sie die pBIBAC-GW-Vektoren: (1) einfache Design und Genmanipulation in E. Coli, und (2) intakt Single Copy Integrationen in Planta bei hohem Wirkungsgrad. Die pBIBAC-GW Vektoren Rendite durchschnittlich 1,7 Integrationen in Arabidopsis mit etwa der Hälfte der transgenen Pflanzen mit einer einzigen integrierten T-DNA10.
Stabile Expression von transgenen ist eine Voraussetzung für die meisten gentechnisch veränderten Pflanzen erzeugt. Stabile Transgene Ausdruck kann durch intakte, Single Copy Integrationen erreicht werden. Arbeiten mit transgenen Pflanzen tragen intakte, Single Copy Integrationen ist jedoch noch wichtiger, wenn zum Beispiel das Ziel, die Effizienz der Chromatin-basierte Prozesse wie Mutagenese, Rekombination, oder Reparatur und die Abhängigkeit von diesen zu studieren Prozesse der Chromatinstruktur an der Insertionsstelle und genomische Position. Für unser Interesse um die Abhängigkeit des Oligonukleotids gerichtet Mutagenese (ODM) auf den lokalen genomische Kontext zu untersuchen war eine Reihe von Reporter Linien mit intakten, Single Copy Integrationen von ein Reportergen Mutagenese erzeugte (Abbildung 2)10. Mit diesem Satz von Linien, zeigte sich, dass die ODM-Effizienz variiert zwischen transgenen Loci integriert genomische Standorten trotz der Transgene Ausdruck ziemlich ähnlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entscheidend für die Erzeugung von gentechnisch veränderten Pflanzen mit einzelnen, intakte Integrationen von ein Transgen ist die Wahl der binären Vektor verwendet. BIBAC Familie Vektoren wurden zur Sequenzen von Interessen, viele Pflanzen Arten23,24,25,26,27,28zu liefern. BIBAC Vektoren, einschließlich BIBAC-GW, Ausbeut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wird unterstützt durch die niederländische Technologie Stiftung STW (12385), gehört die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), und die ist teilweise finanziert durch das Ministry of Economic Affairs (OTP Grant 12385, MS). Wir danken für die Bereitstellung von pCH20, das Rückgrat der BIBAC-GW Vektoren Carol M. Hamilton (Cornell University, USA).
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referências
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
