BIBAC GW バイナリ ベクトルを使用してシングル コピー挿入と遺伝子組換え植物を生成します。
Summary
PBIBAC GW バイナリ ベクトルを使用そのままシングル コピー挿入、簡単なプロセスを生成する遺伝子組換え植物になります。ここでは、一連のプロトコルは、形質転換シロイヌナズナ植物を生成し、イヌイットのための植物をテストのプロセスを介してリーダーを指導し、挿入の数がコピーされます。
Abstract
遺伝子組換え植物を生成、するとき一般に目的は transgene を安定に発現をしています。複数コピーの統合遺伝子サイレンシングにさらされている多くの場合と、遺伝子の 1 つ、そのまま統合が必要です。他の pBIBAC の誘導体のような細菌人工染色体 (pBIBAC GW)、に基づいてゲートウェイ互換性がある二進ベクトルは、高効率で単一コピーの遺伝子の挿入をことができます。、元の pBIBAC に改善は興味のシーケンス組み込むことが今簡単にベクトル転送 DNA (T-DNA) ゲートウェイを複製して、ゲートウェイ カセットは pBIBAC GW にクローン化されています。一般的 pBIBAC GW と変換結果 0.2 – 0.5 の効率 %、T DNA のままのシングル コピー統合を運ぶ、遺伝子組み換えの半分という。グルホシネート アンモニウム抵抗または種皮の植物では、選択した DsRed 蛍光と細菌の選択項目としてカナマイシン抵抗 pBIBAC GW ベクトルがあります。ここでは、一連のプロトコルが表示 pBIBAC GW を用いたトランスジェニック植物を生成するプロセスを介してリーダーを指導: 選択するの変換を植物の pBIBAC GW ベクトルに興味のシーケンスを再結合から始まってアグロバクテリウム、各種、遺伝子組み換え、DNA にしみが付くことを使用して挿入のイヌイットとコピーの数のための植物をテストします。注目は、単一および複数の座位でシングルとマルチ コピー統合を認識する DNA あぶらとり戦略の設計に与えられます。
Introduction
遺伝子組換え植物を生成、するとき通常目的は安定を表明した統合された transgene(s) を持つことです。これは、そのままシングル コピー transgene の統合によって達成できます。複数の統合は、遺伝子サイレンシングにも、遺伝子の発現増加につながることができます。遺伝子のサイレンシングは挿入されたシーケンスはタンデムまたは反転繰り返し1,2,3,4に配置された場合に生じやすい。バイナリのベクトル、アグロバクテリウムのシャトルとして使用されます-植物ゲノムに興味のシーケンスを提供する変換実験を介する。植物のゲノムに統合の数はアグロバクテリウム5,6.にバイナリのベクトルのコピー数に依存多くの一般的に使用されるバイナリ ベクトル高いコピー ベクトル、したがって高の平均遺伝子コピー数をもたらす:シロイヌナズナ53.3 4.9 にコピーします。
T DNA の統合の数は、BIBAC7などまたはA. 根頭がんしゅ病菌染色体5T DNA を起動することにより、 A. 根頭がんしゅ病菌で低コピー数を持つバイナリのベクトルを使用して下げることが。このような場合の transgene の統合の平均数は 25,8,9,10以下です。あることが原因シングル コピー A. 根頭がんしゅ病菌で、大腸菌、BIBAC 誘導体が維持し、150 kb11と同じ大きさの構造を提供します。
GW 互換 BIBAC ベクトル10、12は、ゲートウェイのクローン作成を使用してベクターに興味の遺伝子の簡単な紹介を許可します。ゲートウェイ技術を使用するクローンの手順を大幅に簡略化、大規模な低コピー数ベクトル13,14, 低 DNA 収量などユニークな制限の限られた選択に関連付けられている一般的な問題の解決にも7,11のクローンを作成できるサイト。グルホシネート アンモニウム (pBIBAC-バー-GW) にどちらかの抵抗性または種皮 (pBIBAC RFP GW) 植物 (図 1)10,12で選択した DsRed 蛍光 pBIBAC GW 誘導体があります。両方のベクトルのカナマイシン耐性遺伝子は、細菌の選択マーカーとして使用されます。
PBIBAC GW ベクトルを組み合わせる: (1) 簡単なデザインと大腸菌、および (2) そのままシングル コピー統合planta で高効率で遺伝子操作。単一を運ぶ遺伝子組換え植物のおよそ半分とシロイヌナズナにおける平均 1.7 インテグレーションの pBIBAC GW ベクトル収量は T-DNA10を統合されています。
遺伝子を安定に発現は、ほとんど遺伝子組み換え生成のための要件です。遺伝子発現の安定は、そのまま、単一コピーの統合によって実現できます。そのまま、単一コピーの統合を運ぶ遺伝子組換え植物の使用は、しかし、さらに重要な場合たとえば、目的これらの依存性や修復、組み換え、変異などのクロマチンによるプロセスの効率化を研究することですゲノムの位置と挿入部位のクロマチン構造上のプロセス。我々 の関心ローカル ゲノム コンテキストに関する監督オリゴヌクレオチド変異 (ODM) の依存性を研究する突然変異遺伝子のままに、単一コピーの統合記者行のセットだった生成された (図 2)10。この行セットを使用して、むしろ似ている遺伝子発現レベルにもかかわらず、ゲノムの異なる場所で統合された形質転換における遺伝子座間の ODM 効率が異なることが示されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
生成する重要な遺伝子組み換え transgene の 1 つ、そのまま統合は使用バイナリ ベクトルの選択です。BIBAC 家族のベクトルは、種植物多く23,24,25,26,27,28に興味のシーケンスを提供する使用されています。BIBAC ベクトル、BIBAC-GW を含む高効率単一コ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オランダ技術財団 STW (12385) オランダ組織科学的研究 (NWO) の一部であるし、するが部分的で、経済情勢の大臣 (MS に OTP グラント 12385) 資金を供給によってサポートされます。 我々 は pCH20、BIBAC GW ベクトルのバックボーンを提供するキャロル ・ マクゴーギー ・ ハミルトン (コーネル大学、米国) をありがちましょう。
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referências
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