Generere transgene planter med enkelt-kopi innsettinger bruker BIBAC-GW binære vektor
Summary
Bruke en pBIBAC-GW binære vektor gjør genererer transgene planter med intakt enkelt-kopi innsettinger, en enkel prosess. Her presenteres en rekke protokoller som veileder leseren gjennom prosessen med å generere transgene Arabidopsis planter og testing planter for intactness og kopierer antall skivene.
Abstract
Når du genererer transgene planter, vanligvis er målet å ha stabilt uttrykk for en transgene. Dette krever en enkelt, intakt integrasjon av transgene, som flere kopier integrasjoner ofte gjennomgår genet stanse. Gateway-kompatible binære vektor basert på bakteriell kunstig kromosomene (pBIBAC-GW), som andre pBIBAC derivater, tillater innsetting av enkelt-kopi effekter av transgener med høy effektivitet. Som en forbedring til den opprinnelige pBIBAC, er en Gateway kassett blitt klonet i pBIBAC-GW, slik at sekvenser av interesse kan nå enkelt innlemmes i vektor overføring DNA (T-DNA) av Gateway kloning. Vanligvis transformasjonen med pBIBAC-GW resulterer i en virkningsgrad på 0,2-0,5%, der halvparten av transgenics bære en intakt enkelt-kopi integrasjon av T-DNA. PBIBAC-GW vektorer er tilgjengelig med motstand mot Glufosinate-ammonium eller DsRed fluorescens i frø frakker velges i planter, og motstand mot kanamycin som en markering i bakterier. Her en rekke protokoller er presentert som veileder leseren gjennom prosessen med å generere transgene planter ved hjelp av pBIBAC-GW: fra recombining sekvenser av interesse i pBIBAC-GW vektoren valgfrihet, plante transformasjon med Agrobacterium, transgenics, og teste planter for intactness og kopierer antall innsettinger bruker DNA blotting. Oppmerksomhet er gitt til utforme en DNA blotting strategi å gjenkjenne enkelt – og multi – kopi integreringer på én eller flere loci.
Introduction
Når du genererer transgene planter, er vanligvis målet å ha integrert transgene(s) stabilt uttrykt. Dette kan oppnås ved intakt enkeltutgave integrasjoner av en transgene. Flere integrasjoner kan føre til økt uttrykk for en transgene, men også å slå av genet. Stanse effekter av transgener er mer sannsynlig hvis innsatte sekvenser er ordnet i tandem eller invertert gjentar1,2,3,4. Binær vektorer er brukt som transport i Agrobacterium-mediert transformasjon eksperimenter for å levere sekvenser av interesse i anlegget genomer. Hvor mange integreringer til et anlegg genom er avhengig av kopien antall binære vektoren i Agrobacterium tumefaciens5,6. Mange brukte binære vektorer er høy kopi vektorer, og dermed gi en høy gjennomsnittlig transgene kopi nummer: 3,3 til 4.9 kopier i Arabidopsis5.
Antall T-DNA integrasjoner kan senkes ved hjelp av binær vektorer som har en lav-kopi nummer i A. tumefaciens, som BIBAC7, eller ved å lansere en T-DNA fra A. tumefaciens kromosom5. Gjennomsnittlig antall transgene integrasjoner i slike tilfeller er under 25,8,9,10. Grunn til å være enkelt-kopi i A. tumefaciens, og også i Escherichia coli, BIBAC-derivater kan opprettholde og levere konstruksjoner opptil 150 kb11.
GW-kompatible BIBAC vektorer10,12 tillate enkel innføring av gener av interesse i vektoren bruker Gateway kloning. Bruk av Nøkkelteknologien forenkler kloning prosedyren, men overvinner også vanlige problemer forbundet med store antall lav-Kopier vektorer13,14, som en lav DNA avkastning og et begrenset utvalg av unike begrensning nettsteder tilgjengelig for kloning7,11. PBIBAC-GW derivater er tilgjengelig med enten motstand mot Glufosinate-ammonium (pBIBAC-BAR-GW) eller DsRed fluorescens i frø strøk (pBIBAC-RFP-GW) velges i planter (figur 1)10,12. For både vektorer brukes en kanamycin motstand genet som markøren i bakterier.
PBIBAC-GW vektorer kombinere: (1) lett design og genetisk manipulasjon i E. coli, (2) intakt enkelt-kopi integrasjoner og planta med høy effektivitet. PBIBAC-GW vektorer avkastningen på gjennomsnittlig 1,7 integreringer i Arabidopsis omtrent halvparten av transgene planter bærer en enkelt integrert T-DNA10.
Stabil uttrykk for effekter av transgener er en forutsetning for de fleste transgenics generert. Stabil transgene uttrykk kan oppnås ved intakt, enkelt-kopi integrasjoner. Arbeide med transgene planter bærer intakt, enkelt-kopi integrasjoner er enda mer viktig hvis for eksempel målet er å studere effektiviteten i chromatin prosesser, som mutagenese, rekombinasjon, eller reparer og avhengigheten av disse prosesser på hvor genomisk og chromatin strukturen ved innsetting site. For vår interesse, for å studere avhengigheten av oligonucleotide regissert mutagenese (ODM) på lokal genomisk sammenheng, ble et sett med reporter linjer med intakt, enkelt-kopi integrasjoner med et mutagenese reporter generert (figur 2)10. Bruker dette settet med linjer, ble det vist at ODM effektiviteten varierer mellom transgene loci integrert på forskjellige genomisk steder, til tross for transgene uttrykk nivåene blir ganske likt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritisk til å generere transgenics med enkelt, intakt integrasjoner av en transgene er valg av binære vektoren brukes. BIBAC familien vektorer har blitt brukt til å levere sekvenser av interessene til mange plante arter23,24,25,26,27,28. BIBAC vektorer, inkludert BIBAC-GW, gi enkelt-kopi integrasjoner med høy effektivitet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen er støttet av den nederlandske teknologi Foundation STW (12385), som er en del av Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO), og som er delvis finansiert av Ministry of Economic Affairs (OTP Grant 12385 til MS). Vi takker Carol M. Hamilton (Cornell University, USA) for å gi pCH20, ryggraden i BIBAC-GW vektorer.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referências
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
