Создание трансгенных растений с одной копии вставки с помощью бинарный вектор BIBAC-GW
Summary
С помощью бинарный вектор pBIBAC-GW делает создания трансгенных растений с нетронутыми одной копии вставки, легкий процесс. Здесь ряд протоколов представлены Путеводитель читателя через процесс создания трансгенных растениях Arabidopsis и тестирования растений для целостности и копировать количество вставок.
Abstract
При генерации трансгенных растений, обычно цель заключается в том, чтобы иметь стабильные выражение трансген. Это требует единого, нетронутыми интеграции трансген, интеграции нескольких копирования часто подвергаются сайленсинга генов. Шлюз совместимых бинарный вектор, основанные на бактериальных искусственных хромосом (pBIBAC-GW), как и другие производные pBIBAC, позволяет вставки одной копии трансгенов с высокой эффективностью. Как улучшение в оригинальной pBIBAC шлюз кассету был клонирован в pBIBAC-GW, так что последовательности интерес может теперь быть легко включены в вектор передачи ДНК (T-ДНК) путем клонирования шлюза. Обычно, преобразования с pBIBAC-GW приводит к эффективности 0,2 – 0,5%, при котором половина мутация нести нетронутыми поштучными интеграции T-ДНК. PBIBAC-GW векторов доступны с устойчивость к глюфосинату аммония или DsRed флуоресценции в пальто семян для отбора в растениях и устойчивость к канамицину как выделение бактерий. Здесь, что руководство читателя через процесс создания трансгенных растений, с помощью pBIBAC-GW представлены серии протоколов: начиная от комбинирование последовательности интерес в pBIBAC-GW вектора выбора, к заводе преобразования с Agrobacterium, выбор мутация и тестирования растений для целостности и копировать количество вставок, используя ДНК blotting. Внимание уделяется разработке стратегии переноса ДНК признать одним и несколькими копиями внедрений в одной системе и нескольких локусов.
Introduction
При генерации трансгенных растений, обычно цель заключается в том, чтобы иметь комплексный transgene(s) стабильно выразил. Это достигается за счет нетронутыми Поэкземплярная интеграция трансген. Несколько интеграции может привести к увеличению выражение трансген, но и для подавления экспрессии гена. Глушителей трансгенов является более вероятным, если вставленный последовательности расположены в тандеме или перевернутый повторяется1,2,3,4. Бинарных векторов используются как Трансфер в Agrobacterium-опосредованной преобразования экспериментов, чтобы доставить последовательности интерес в геномах растений. Количество внедрений в геном растения зависит количество копию бинарный вектор. Agrobacterium tumefaciens5,6 Многие часто используемые бинарных векторов высокой копии векторы и поэтому дают высокий средний трансген копии номер: 3.3 до 4,9 копий в проростках Arabidopsis5.
Количество внедрений T-ДНК может быть снижен с помощью бинарных векторов, которые имеют низкий копия число в A. tumefaciens, например BIBAC7, или путем запуска T-ДНК от A. tumefaciens хромосомы5. Среднее количество внедрений трансген в таких случаях является ниже 25,8,9,10. Из-за одной копии в A. tumefaciens, а также кишечная палочка, BIBAC-производные может поддерживать и доставить конструкции, как большой, как11150 КБ.
GW-совместимых BIBAC векторов10,12 позволяют легко введение в vector с использованием шлюза клонирования генов интерес. Использование шлюза технологии значительно упрощает процесс клонирования, но также преодолевает общие проблемы, связанные с большими низким копии число векторов13,14, таких как низкая доходность ДНК и ограниченный выбор уникальных ограничений сайты, доступные для клонирования7,11. PBIBAC-GW производные доступны либо сопротивление к глюфосинату аммония (pBIBAC бар-GW) или DsRed флуоресценции в пальто (pBIBAC ЗП-GW) семян для выбора растений (рис. 1)10,12. Для обоих векторов канамицин сопротивления ген используется в качестве маркера выделения бактерий.
PBIBAC-GW векторов объединить: (1) легкий дизайн и генетических манипуляций в E. coliи (2) нетронутыми поштучными внедрений в planta с высокой эффективностью. PBIBAC-GW векторов урожайность в среднем 1,7 внедрений в проростках Arabidopsis с примерно половина трансгенных растений, перевозящих один интегрированный10T-ДНК.
Стабильные выражение трансгенов является требованием для большинства мутация генерируется. Стабильная трансген выражение может быть достиган нетронутыми, одной копии интеграций. Работа с трансгенных растений, перевозящих нетронутыми, одной копии интеграции является, однако, еще более важно, если например, целью является изучение эффективности процессов, основанных на хроматина, например мутагенеза, рекомбинации, или ремонт и зависимость от этих процессы на геномной расположение и структура хроматина в месте вставки. Для наших интересов изучать зависимость олигонуклеотида Направленный мутагенез (ODM) в контексте местных геномной, набор репортер линий с неповрежденными, одной копии интеграций мутагенеза Репортер ген был сгенерированный (рис. 2)10. С помощью этого набора строк, было показано, что эффективность ODM колеблется от трансгенных локусов, интегрированный в разных местах генома, несмотря на довольно аналогичные уровни выражения трансген.
Protocol
Representative Results
Discussion
Решающее значение для генерации мутация с одной, нетронутыми интеграций трансген – это выбор бинарный вектор, используемый. BIBAC семьи векторов были использованы для доставки последовательности интересов многих растений видов23,24,25,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается голландской технологии фонд STW (12385), которая является частью Нидерландской организации научных исследований (НВО), и которая частично финансируется министерства экономических дел (Грант 12385 OTP для MS). Мы благодарим Кэрол м. Гамильтон (Корнельский университет, Соединенные Штаты) за предоставление pCH20, костяк BIBAC-GW векторов.
Materials
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
Referências
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning. , (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
