Denne metoden tillater generering av tetraploid og triploid Caenorhabditis nematoder fra diploide belastning. Polyploid stammer generert av denne metoden har blitt brukt til å studere kromosom interaksjoner i meiotic prophase, og denne metoden er nyttig for å undersøke viktige grunnleggende spørsmål i cellen, utviklingsmessige, evolusjonær, og kreft biologi.
Mekanismer som involverer hele genomet polyploidy spille viktige roller i utviklingen og utvikling; en unormal generasjon av tetraploid celler har også vært forbundet med både progresjon av kreft og utvikling av resistens. Inntil nå har det ikke vært mulig å lett manipulere ploidy av flercellede dyr uten å generere mest sterilt avkom. Presentert her er en enkel og rask protokoll for å generere tetraploid Caenorhabditis elegans dyr fra diploide belastning. Denne metoden lar brukeren opprette en skjevhet i kromosom segregering under meiose, til slutt øke ploidy i C. elegans. Denne strategien er avhengig av forbigående reduksjon av uttrykk for rec-8 genet å generere diploide gameter. En rec-8 mutant produserer diploide gameter som kan potensielt produsere tetraploids etter befruktning. Denne medgjørlig ordningen har blitt brukt til å generere tetraploid stammer bærer mutasjoner og kromosom rearrangements å få innsikt i chromosomal dynamikk og interaksjoner under sammenkoblingen og Adept i meiose. Denne metoden er effektiv for å generere stabil tetraploid stammer uten genetiske markører, kan brukes på diploide belastning, og kan brukes til å utlede triploid C. elegans. Denne enkle metoden er nyttig for å undersøke andre grunnleggende biologisk spørsmål gjelder genomet ustabilitet, gene dosering, biologiske skalering, ekstracellulære signalering, tilpasning stress, utvikling av resistens mot narkotika, og mekanismer for artsdannelse.
Hele genomet polyploidy finnes i naturen og er ofte et nødvendig skritt i tilpasning, artsdannelse, organogenesen, sårheling og biologiske skalering; Det er også kjent for å fremme både kreft og motstand mot narkotika1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. landbruks-og fiskeri generere polyploid planter, fisk og skalldyr ved kjemisk behandling (f.eks, colchicine og orzalin) å få raskere vekst og større avlinger og husdyr13, 14,15. Eksperimentelle og ineffektiv produksjon av tetraploids finnes for de mus og sebrafisk modell systemer16,17. Imidlertid er de fleste eller alle polyploid flercellede dyr generert embryonically dødelig eller sterile og dermed ikke ideelt for laboratoriestudier på effekter av polyploidy i en flercellet organisme. Derfor er noen forståelse av hele genomet polyploidization i multicellular organismer begrenset til nært beslektede arter evolusjonære siste polyploidization hendelser18,19,20 . En bane til å fremme spørsmål av rollen biologiske eller konsekvenser av polyploidization er bruk av C. elegans modell systemet. Viktigere, C. elegans er et tett genetisk system som vanligvis finnes som en diploide, inneholder bare fem autosomes (A) og en sex-kromosom (X) per genom, er gjennomsiktig tillater i vivo observasjon av biologiske prosesser, og har en kort livssyklus av 3-4 dager (fra egg til seksuell modne voksen). C. elegans har vist seg å kunne reprodusere som et tetraploid, som er den vanligste typen av hele genom polyploidy i naturen. Triploid dyr kan genereres ved krysset tetraploids med diploids, men deres ploidy er ikke stabil, og stammer blir diploide innen et par generasjoner.
I de siste tiårene bare en håndfull av levedyktig og fruktbare C. elegans tetraploids stammer ble isolert i laboratoriet, bruke en strategi som er arbeidskrevende og genererer bare begrenset typer stammer21,22, 23. denne strategien genererer C. elegans tetraploids av varme-sjokk behandlinger, som antagelig påvirker kromosom segregering i kjønnscellene, etterfulgt av en screening for antatte polyploid dyr med genetiske markører. Disse tetraploids var svært nyttige innlegg av hvordan denne Rundormer bestemmer om å bli mann eller Hermafroditt. Senere studier brukt de tilgjengelige stammene for å undersøke vekst, gene dose, og regulering av Adept under meiose i denne Rundormer21,24,25,26. Dessverre var disse studiene begrenset av vanskeligheten i å generere nye tetraploid stammer og bakgrunn genetiske markører disse stammer inneholdt. Vist her er en enkel og rask protokoll generere stabil tetraploids, som har blitt brukt til å generere stammer å studere regulering av Adept under meiose27.
Som i naturen, kan polyploidization oppstå ved dannelsen av diploide i stedet for haploid gameter. Våre funn at en meiose-spesifikke cohesin komponent mutant rec-8 genererer diploide sperm og oocytes indikerte at banket ned rec-8 genet vil føre til produksjon av tetraploid avkom (figur 1)27, 28,29. Genererer tetraploid stammer bare involverer banket ned rec-8 av RNA-interferens (RNAi) i to generasjoner for phenocopy rec-8 mutant diploide gameter. Antatte polyploids kan lett identifiseres av deres lengre enn normal kroppsbygning. Polyploids er bekreftet som fullstendig eller delvis tetraploids ved å telle antall kromosomer per kjerne når stabil linjer er etablert.
Strategien beskrevet her kan generering av stabile tetraploid Caenorhabditis Rundormer stammer fra første diploide genetisk bakgrunn eller karyotype uten bruk av genetiske markører. Siden denne protokollen er mer effektiv, allsidig og enkel enn ordningen tidligere, vil det utvide verktøyene som trengs spørre rollene til polyploidization i grunnleggende prosesser utvikling, genomet stabilitet og utviklingen i flercellet organismer. Bare overskuelig begrensning i bruk av denne protokollen er genetisk bakgrunn motstandsdyktig mot RNAi.
Produksjon av haploid (n) gameter er nøkkelen til å generere en diploide (2n) zygote ved befruktning. Denne reduksjonen i genomet oppnås under meiose med to påfølgende celledelinger etter en enkelt genomet duplisering. Generere haploid gameter, C. elegans, som med de fleste andre Metazoer, skille moderskap og farskap-avledede homologs i første divisjon, mens søster chromatids fra hver homolog skille i divisjon. En måte at hele genomet polyploidy oppstår i naturen er gjennom generasjon gameter som ikke halvparten genomet størrelsen under meiose.
Det har vært kjent i over 50 år som tetraploid C. elegans nematoder er levedyktig og frodig. Nigon23, og senere Madl og Herman22, genereres og identifisert en håndfull C. elegans tetraploids ved å forstyrre meiotic kromosom segregering bruke varme-sjokk behandlinger og genetiske markører, henholdsvis. Ett ekstra C. briggsae tetraploid belastning avledet bruker denne protokollen over 30 år senere24. Disse tetraploids ble benyttet for å undersøke hvordan C. elegans avgjøre om å bli mann eller Hermafroditt, hvordan ploidy regulerer vekst og størrelse, og analysere sammenkoblingen og Adept i meiose25,26, 38 , 39 , 40. men disse og andre studier som krever bruk av bestemte tetraploids eller triploid stammer var begrenset av vanskeligheten i å generere tetraploid stammer av denne metoden.
Protokoll beskrevet her kan generering av stabil full 4A, 4 X og delvis 4A, 3 X tetraploid Caenorhabditis Rundormer stammer fra noen innledende diploide genetisk bakgrunn eller karyotype uten bruk av genetiske markører.
Tetraploidy kan oppstå med mer enn én mekanisme i C. elegans:
Madl og Herman foreslått at de tetraploid stammene de generert sannsynlig avledet fra en triploid mellomstatus. Deres stammer ble innhentet gjennom valg over flere generasjoner eller ved å krysse den antatte triploid mellomliggende med diploide menn22. Feil i kromosom partisjonering i rec-8 mutanter som gir opphav til diploide oocytes og sperm foreslå en annen mulig mekanisme som tetraploid dyr kan oppstå med rec-8 RNAi ordningen27.
Rec-8 RNAi behandlet hermafroditter kunne produsere diploide oocytes og spermatocytes, som gir opphav til tetraploid dyr etter befruktning. Samsvar med denne muligheten er det faktum at noen av de klonede F2 hermafroditter ga opphav til stabile Lon stammer i neste generasjon, som antyder at de klonede Lon F2 hermafroditter der allerede tetraploid. I krysset ordningen, er den første generasjonen av rec-8 RNAi behandlet hermafroditter krysset med ubehandlet menn. Diploide spermatocytes kan fortsatt oppstå hos menn fordi korset er gjort i nærvær av bakterier uttrykke rec-8 dsRNA og derfor menn er utsatt til rec-8 RNAi under parring i minst 3 dager. Derfor kan Lon polyploids i cross-fertilizing ordningen også har dannet fra befruktning av diploide oocytes av diploide sperm. Stabil tetraploid stammer kan oppstå fra enten fertilisering mellom diploide gameter eller krysset triploid dyr med oocytes av variabel ploidy diploide dyr produserer haploid sperm.
Viktige hensyn:
Selv-versus cross-fertilization ordninger:
Ordningen med selv gjødsling rec-8 RNAi behandlet F1 hermafroditter og ordningen med kryssing av behandlet hermafroditter med ubehandlet menn både ga opphav til 4A, 4 X og 4A, 3 X tetraploid stammer. Selv om flere polyploids ble først isolert fra selv gjødslende ordningen, flere av disse polyploid dyrene ble sterile og dermed begge er like effektiv til å produsere tetraploid stabile stammer. Årsaken til økt suksess og sterilitet i selv gjødslende ordningen er ukjent. Selv om begge er like effektive, er selv gjødslende ordningen lettere som det ikke krever isolasjon av menn for mating. I tillegg når belastningen av interesse er ineffektiv eller defekt på parring, ville selv gjødslende ordningen være å foretrekke. Cross-fertilizing ordningen kan brukes for å generere komplekse tetraploids som inneholder mer enn to versjoner av et enkelt kromosom.
Modifikasjoner og begrensninger:
Foreløpig innebærer denne protokollen rec-8 RNAi behandling av fôring bakterier uttrykke dsRNA for rec-8 genet. Denne protokollen fungerer derfor ikke i Caenorhabditis arter ikke svarer til RNAi av mate, eller mutanter defekt i miljømessige eller systemisk spredning av RNAi mellom vev41,42,43. Dette problemet kan potensielt løses ved å innføre RNAi behandling av direkte injeksjon av dsRNA rundt direkte inn i germline.
Triploid dyr må genereres ved krysset en tetraploid til en diploide dyr som den var avledet, fordi denne ordningen ikke genererer stabil triploid stammer44,45. Bare 15% av eggene var far til ved triploids Luke, og deres avkom er hovedsakelig sterilt avkom på grunn av aneuploidy. I tillegg pleier få overlevende fruktbare avkommet å være full eller nær diploids innen et par generasjoner. Dette er sannsynligvis, iallfall delvis, fordi oocytes delvis retter Trisomi ved å segregere tredje kromosomet i polar kroppen i første meiotic divisjon.
En uoverstigelig begrensningen for denne protokollen er at det ikke fungerer for å gjøre tetraploids av mutanter som påvirker komponenter av RNAi-maskiner fordi de er resistente mot RNAi behandling46.
Feilsøking:
REC-8 RNAi:
Noen er avgjørende for denne protokollen skal lykkes. Først er å bruke fersk IPTG og nystekte IPTG NMG plater for induksjon av rec-8 dsRNA produksjon i bakterier HT115 bakterier bærer klone rec-8 (W02A2.6). IPTG er følsomt for lys, og det er viktig å redusere eksponering til plater. IPTG plater kan lagres til en måned på 4 ° C i mørket. Andre ga rec-8 (W02A2.6) RNAi bakteriell HT115 stammer fra Ahringer-biblioteket (Kamath og Ahringer 2003) en sterkere rec-8 fenotypen enn andre tilgjengelige rec-8 HT115 kloner.
Tetraploid belastning vedlikehold:
Tetraploid stammer vokser svært sakte og produsere minst 50 progenies per generasjon47. Alle identifisert tetraploid stammer er relativt stabile, men de kan bryte ned og bli diploide når stresset (Jonathan Hodgkin personlig kommunikasjon og våre upubliserte observasjoner). Derfor er det viktig å merke seg at når tetraploid stammer er dyrket ved 25 ° C, varme-sjokkert, sultet, eller frosset og tint, de raskt kan gå til diploidy, så det er viktig å velge Lon dyrene ved tining disse stammer eller når utsette disse stammer stressende forhold som kan føre dem til å gå tilbake.
Mulig programmer:
Undersøkelse av effekten eller rollen hele genomet polyploidization i utviklingen, celle syklus, genuttrykk og utvikling i multicellular organismer er basert på sammenligninger mellom: cellene i en organisme som inneholder forskjellige ploidy, samme celle typer i nærstående arter med forskjellige ploidy eller arter som har gjennomgått evolusjonært meritter polyploidization og fysisk isolasjon3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Selv om tetraploids kan utledes fra sebrafisk og mus modellsystemer, er deres avkom sterile eller embryonically dødelig16,17. Dessuten, disse modellsystemer har lang levetid sykluser sammenlignet C. elegans, og de tilgjengelige metodene til å generere polyploid dyr er kom. C. elegans stammer avledet av denne metoden vil derfor være instrumentell for å fremme en undersøkelse på effekter og roller av hele genom polyploidy i multicellular organismer.
Siden en triploid kan være avledet fra en tetraploid ved å krysse tetraploid til den opprinnelige diploide, gir en sammenligning mellom diploids, triploids og tetraploids som bare avviker i antall genomet eksemplarer, en unik og enestående mulighet til å evaluere tilsvarende dyr/organer/celler med forskjellige genomet størrelse (eller genet dose). Fleksibilitet og brukervennlighet ordningen beskrevet her har tillatt oss å generere dusinvis av tetraploid stammer fra forskjellige genetisk diploide bakgrunner eller karyotypes. Noen av disse stammer var allerede brukt til spørringen mekanismer homologe kromosomer sammenkoblingen og Adept under meiose27.
Wild type og mutant tetraploid stammer bærer fluorescerende markører gir nye muligheter for forespørsel å forstå forholdet mellom genomet størrelse og kjernefysiske/stoffer ratio på intracellulær/mobil/orgel og hele dyr skalering, hele genom polyploidization på tilpasning, artsdannelse, gene dose og uttrykk og vev og organ utvikling. I tillegg til studiet av biologiske skalering vil generering av tetraploid stammer betydelig videre spørringer grunnleggende biologisk spørsmål gjelder ekstracellulære signalnettverk, genomet ustabilitet, endoreduplication, hele genom duplisering, gene dosering, tilpasning til stress, utvikling av resistens mot legemidler og mekanisme artsdannelse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Caenorhabditis genetikk Center (finansiert av National Institute of Health (NIH) Office for forskning infrastruktur programmer P40 OD010440) for stammer. Forfatterne vil gjerne takke Baptiste Roelens og Eli Lessman, for å gi oss med konstruktive tilbakemeldinger og Mano Lab CCNY, CUNY for bruk av deres laboratorium for en del av filmingen og for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av en PSC-CUNY award TRADB-46-113 og NIH gi 1SC2GM118275-01. M.S. ble delvis støttet av en kanadisk Institutt for Health (CIHR) postdoktorstipend, og E.K. ble støttet av NIH/NIGMS stige gi GM062981.
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NGM agar plates | |||
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Culture | |||
LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LB Agar plates | |||
LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotics | |||
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAi Clones | |||
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |