Denna metod möjliggör generering av gräsart och triploid Caenorhabditis nematoder från någon diploida stam. Polyploida stammar som genereras av denna metod har använts för att studera kromosom interaktioner i meiotiska profas, och denna metod är användbar för att undersöka viktiga grundläggande frågor i cell, utvecklingsmässiga, evolutionär, och cancerbiologi.
Mekanismer som involverar hela genomet polyploidi spelar viktiga roller i utveckling och evolution; också, en onormal generering av gräsart celler har associerats med både utvecklingen av cancer och utveckling av resistens. Hittills har det inte varit möjligt att enkelt manipulera skall ploiditeten flercelliga djur utan att generera mestadels steril avkomma. Presenteras här är ett enkelt och snabbt protokoll för generering av gräsart Caenorhabditis elegans djur från någon diploida stam. Denna metod tillåter användaren att skapa en bias i kromosomsegregering under meios, slutändan öka ploiditeten i C. elegans. Denna strategi bygger på en övergående minskning av uttryck av genen rec-8 att generera diploida könsceller. En rec-8 mutant producerar diploida könsceller som potentiellt kan producera tetraploids vid gödsling. Detta eftertraktansvärda system har använts för att generera gräsart stammar bär mutationer och kromosom rearrangements att få insikt i kromosomala dynamik och interaktioner under ihopparning och mås i meios. Denna metod är effektiv för att generera stabil gräsart stammar utan genetiska markörer, kan tillämpas på någon diploida stam och kan användas för att härleda triploid C. elegans. Denna enkla metod är användbar för att undersöka grundläggande biologiska frågor relevanta för genomet instabilitet, gen dosering, biologisk skalning, extracellulär signalering, anpassning till stress, utveckling av resistens mot läkemedel, och mekanismer för artbildning.
Hela genomet polyploidi finns i naturen och är ofta ett nödvändigt steg i anpassning, artbildning, organogenes, sårläkning och biologisk skalning; Det är också känt att främja både cancer och motstånd mot droger1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. jordbruk samt fiske industrier generera polyploida växter, fisk och skaldjur genom kemisk behandling (t.ex.kolkicin och orzalin) att få snabbare tillväxttakt och skrymmande grödor och boskap13, 14,15. Experimentella och ineffektiv produktion av tetraploids finns för mus och zebrafisk modellen system16,17. Dock är de flesta eller alla polyploida flercelliga djur genereras embryonically dödliga eller sterila och således inte idealiskt för laborativa studier om effekterna av polyploidi i en multicellulär organism. Följaktligen, någon förståelse av hela genomet polyploidization i flercelliga organismer har begränsats till närbesläktade arter från evolutionära senaste polyploidization evenemang18,19,20 . En väg att avancera frågor av biologiska roll eller följder av polyploidization är användningen av C. elegans modell systemet. Ännu viktigare, C. elegans är ett fogligt genetiska system som normalt finns som en diploida, innehåller endast fem autosomer (A) och en kön kromosom (X) per genomet, är transparent vilket möjliggör i vivo observation av biologiska processer, och har kort livslängd på 3-4 dagar (från ägg till könsmogna vuxen). C. elegans har visat sig kunna reproducera som en gräsart, vilket är den vanligaste typen av hela genomet polyploidi i naturen. Triploid djur kan genereras genom att korsa tetraploids med diploider, men deras ploiditeten är inte stabil och stammar bli diploida inom ett par generationer.
Under de senaste decennierna bara en handfull av livskraftiga och fruktbara C. elegans tetraploids stammar isolerades i laboratoriet, använder en strategi som är mödosam och genererar endast begränsade typer av stammar21,22, 23. denna strategi genererar C. elegans tetraploids av heat-shock behandlingar, vilket förmodligen påverkar kromosomsegregering i könsceller, följt av en screening för förmodad polyploida djur med hjälp av genetiska markörer. Dessa tetraploids var extremt användbara i utredningen av hur denna nematod avgör om att bli manlig eller hermafrodit. Senare studier används de tillgängliga stammarna för att undersöka den tillväxt, gen dos och reglering av synapsis under meios i denna nematoder21,24,25,26. Tyvärr, dessa studier var begränsad av svårigheten att generera nya gräsart stammar och de bakgrunden genetiska markörerna dessa stammar som finns. Här visas en enkel och snabb protokollet att generera stabila tetraploids, som har använts för att generera stammar för att studera reglering av synapsis under meios27.
Som i naturen, kan polyploidization uppstå vid bildandet av diploida istället för haploida könsceller. Vår slutsats att en meios-specifika cohesin komponent mutant rec-8 genererar diploida spermier och äggceller indikerade att knacka ner rec-8 genen skulle resultera i produktionen av gräsart avkomma (figur 1)27, 28,29. Generera gräsart stammar helt enkelt innebär att knacka ner rec-8 av RNA-interferens (RNAi) för två generationer för att phenocopy den rec-8 mutant diploida könsceller. Förmodad polyploids lätt kan identifieras genom sin längre än normal kroppsbyggnad. Polyploids bekräftas som helt eller delvis tetraploids genom att räkna antalet kromosomer per kärna när stabil linjerna är etablerade.
Den strategi som beskrivs här möjliggör generering av stabil gräsart Caenorhabditis nematoder stammar från inledande diploida genetisk bakgrund eller karyotyp utan användning av genetiska markörer. Eftersom detta protokoll är mer effektiv, mångsidig och enkel än de system som tidigare använts, kommer att det expandera de verktyg som behövs för att fråga polyploidization i grundläggande processer av utveckling, genomet stabilitet och evolution i flercelliga roller organismer. Bara förutsebara begränsning i användningen av detta protokoll är i genetiska bakgrunder resistenta mot RNAi.
Produktionen av haploida (n) könsceller är nyckeln till att generera en diploida (2n) zygot vid befruktning. Denna minskning av genomet sker under meios med två på varandra följande celldelningar efter en enda genomet dubbelarbete. För att generera haploid könsceller, C. elegans, som med de flesta andra metazoans, segregera maternellt – och flänga-härledda homologs i den första divisionen, medan syster kromatiderna från varje homolog segregera i andradivisionen. Ett sätt att hela genomet polyploidi uppstår i natur är genom generering av könsceller som misslyckas med att halva genomet storlek under meios.
Det har varit känt i över 50 år att gräsart C. elegans nematoder är livskraftiga och fruktbara. Nigon23, och senare Madl och Herman22, genereras och identifierade en handfull C. elegans tetraploids genom att störa meiotiska kromosomsegregering med heat-shock behandlingar och använda genetiska markörer, respektive. En enda ytterligare C. briggsae gräsart stam beräknades genom att använda detta protokoll över 30 år senare24. Dessa tetraploids utnyttjades för att undersöka hur C. elegans avgöra om att bli manlig eller hermafrodit, hur ploiditeten reglerar tillväxt och storlek, och att analysera ihopparning och mås i meios25,26, 38 , 39 , 40. men dessa och andra studier kräva användning av särskilda tetraploids eller triploid stammar begränsades av svårigheten att generera gräsart stammar av denna metod.
Protokollet beskrivs här möjliggör generering av stabil full 4A, 4 X och partiell 4A, 3 X gräsart Caenorhabditis nematoder stammar från någon initial diploida genetisk bakgrund eller karyotyp utan användning av genetiska markörer.
Tetraploidy kan uppstå med mer än en mekanism i C. elegans:
Föreslås att de gräsart stammar de genererat sannolikt härrör från en triploid mellantillstånd madl och Herman. Sina stammar erhölls genom urval över flera generationer eller genom att korsa den förmodade triploid mellanliggande med diploida män22. Defekter i kromosom partitionering i rec-8 mutanter som ger upphov till diploida ägg och spermier föreslår en annan möjlig mekanism genom vilken gräsart djur kan uppstå med rec-8 RNAi stödordningen27.
Rec-8 RNAi behandlas hermafroditer kunde producera diploida oocyter och spermatocyter, vilket skulle ge upphov till gräsart djur vid befruktning. Överensstämmer med denna möjlighet är det faktum att några av de klonade F2 hermafroditer gav upphov till stabil Lon stammar i nästa generation, vilket tyder på att de klonade Lon F2 hermafroditer där redan gräsart. I korsningen systemet korsas den första generationen av rec-8 RNAi behandlas hermafroditer med obehandlade hanar. Diploida spermatocyter kunde uppkomma hos män eftersom korset sker i närvaro av bakterier att uttrycka rec-8 dsRNA och således män utsätts för rec-8 RNAi under parning för minst 3 dagar. Därför kan de Lon-polyploids i korsbefruktande systemet också ha bildats från befruktning diploida oocyter av diploida spermier. Stabil gräsart stammar kan uppstå från antingen befruktning mellan diploida könsceller eller passerar triploid djur som innehåller oocyter från variabel ploiditeten med diploida djur producera haploida spermier.
Viktiga överväganden:
Self-kontra korsbefruktning system:
Systematiken i själv gödsling rec-8 RNAi behandlas F1 hermafroditer och systemet som inbegriper passage av behandlade hermafroditer med obehandlade hanar båda gav upphov till 4A, 4 X och 4A, 3 X gräsart stammar. Även om mer polyploids isolerades ursprungligen från systemet med egen gödning, mer av dessa polyploida djur var steril och således båda garantiprogrammen är likaså effektiva på att producera gräsart stabila stammar. Orsaken till ökad framgång och sterilitet i egen gödning systemet förblir okänd. Även om båda systemen är lika effektiva, är egen gödning systemet enklare eftersom det inte kräver isolering av hanar för parning. Dessutom, när stammen av intresse är ineffektiva eller defekt på parning, vore egen gödning systemet att föredra. Korsbefruktande systemet kan användas för att generera komplexa tetraploids som innehåller fler än två versioner av en enda kromosom.
Ändringar och begränsningar:
För närvarande innebär detta protokoll rec-8 RNAi behandling av utfodring bakterier uttrycker dsRNA för rec-8 gen. Detta protokoll fungerar således inte i Caenorhabditis arter svarar inte på RNAi av utfodring, eller i mutanter defekt i miljön eller systemisk spridning av RNAi mellan vävnader41,42,43. Detta problem skulle potentiellt kunna lösas genom att införa RNAi behandling genom direkt injektion av dsRNA sevärdheter direkt in i könsceller.
Triploid djur måste genereras genom att korsa en gräsart till en diploida djur från vilket det tagits, eftersom detta system inte genererar stabil triploid stammar44,45. Endast 15% av äggen efter triploids lucka, och deras avkomma mestadels steril avkomma på grund av aneuploidi. Dessutom tenderar några överlevande fertila avkomman att vara komplett eller nära diploider inom ett par generationer. Detta är sannolikt, åtminstone delvis, eftersom oocyter delvis rättar trisomi av segregerande tredje kromosomen i polar kroppen i den första meiotiska divisionen.
Ett oöverstigligt begränsning av detta protokoll är att det inte fungerar för att göra tetraploids av mutanter som påverkar komponenter av RNAi maskiner eftersom de är resistenta mot RNAi behandling46.
Felsökning:
REC-8 RNAi:
Några överväganden är avgörande för detta protokoll ska lyckas. Först är att använda färska IPTG och nygjorda IPTG NMG plattor för induktion av rec-8 dsRNA produktion i de bakterier HT115 bakteriebärande rec-8 (W02A2.6) klonen. IPTG är ljuskänsligt och det är viktigt att minska ljus exponering för plattor. IPTG plattor kan förvaras upp till en månad vid 4 ° C i mörker. För det andra gav de rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 bakteriestammar från Ahringer bibliotek (Kamath och Ahringer 2003) en starkare rec-8 fenotyp än andra tillgängliga rec-8 HT115 kloner.
Gräsart stam underhåll:
Gräsart stammar växer mycket långsamt och producera högst 50 avkommor per generation47. Alla identifierade gräsart stammar är relativt stabil, men de kan bryta ner och bli diploida när stressad (Jonathan Hodgkin personlig kommunikation och våra opublicerade observationer). Därför är det viktigt att notera att när gräsart stammar odlas vid 25 ° C, värme-chockad, utsvulten, eller fryst och tinad, de kan snabbt återgå till diploidy, så det är viktigt att fortsätta att plocka Lon djuren när avfrostning dessa stammar eller när utsätta dessa stammar till påfrestande förhållanden som kan orsaka dem att återgå.
Möjliga tillämpningar:
Undersökning av effekten eller rollen av hela genomet polyploidization i evolution, cellcykeln, genuttryck och utveckling i flercelliga organismer har förlitat sig på jämförelser mellan: celler i en organism som innehåller olika ploiditeten, samma cell typer i närbesläktade arter med olika ploiditeten eller arter som har genomgått evolutionärt senaste polyploidization händelser och fysisk isolering3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Även om tetraploids kan härledas från zebrafisk och mus modellsystem, är deras avkomma steril eller embryonically dödliga16,17. Dessutom, dessa modellsystem har långa livscykler jämfört med C. elegans, och tillgängliga metoder att generera polyploida djur är komplexa och ineffektiva. Därför, C. elegans stammar härstammar genom denna metod kommer att vara avgörande för att främja någon utredning på effekter och roller av hela genomet polyploidi i flercelliga organismer.
Eftersom en triploid kan härledas från en gräsart genom att korsa gräsart till den ursprungliga diploida, ger en jämförelse mellan diploider, triploids och tetraploids som endast skiljer sig i antalet genomet kopior, en unik och oöverträffad möjlighet att utvärdera motsvarande djur/organ/celler med olika genomet storlek (eller gen dos). Flexibilitet och användarvänlighet av systemet beskrivs här har tillåtit oss att skapa dussintals gräsart stammar från olika genetiska diploida bakgrunder eller karyotypes. Några av dessa stammar var redan brukade fråga mekanismer av homologa kromosom ihopparning och synapsis under meios27.
Vildtyp mutant gräsart stammar och bära fluorescerande markörer kommer att ge nya vägar för att förstå relationer mellan genomet storlek och kärn/cytosol baserat på intracellulära/mobilnät/orgel och hela djuret skalning, hela genomet polyploidization på anpassning, artbildning, gen dos och uttryck och vävnads- och utveckling. Förutom studien av biologisk skalning kommer generering av gräsart stammar avsevärt ytterligare frågor av grundläggande biologiska frågor relevanta för extracellulära signalering, genomet instabilitet, endoreduplikation, hela genomet dubbelarbete, gen dosering, anpassning till stress, utveckling av resistens mot droger och mekanism artbildning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Caenorhabditis genetik centrum (finansierad av National Institute of Health (NIH) Office av forskning infrastruktur program P40 OD010440) för stammar. Författarna vill tacka Baptiste Roelens och Eli Lessman, för att förse oss med konstruktiv feedback och den Mano Lab vid CCNY, CUNY för användning av deras laboratorium för del av inspelningen och för deras hjälp. Detta arbete stöds av en PSC-CUNY award TRADB-46-113 och NIH bevilja 1SC2GM118275-01. M.S. stöddes delvis av en Canadian Institute of Health (CIHR) postdoktorsstipendium och E.K. stöddes av den NIH/NIGMS stiga bevilja GM062981.
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NGM agar plates | |||
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Culture | |||
LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LB Agar plates | |||
LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotics | |||
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAi Clones | |||
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |