I dette arbejde præsenteres en protokol for signal forstærkning af nanoprobe-baseret biosensing. Protokollen er baseret på en reduktion af chloroauric syre på overfladen af eksisterende nanoprobes, der består af guld, sølv, silica eller jernoxid nanopartikler.
Brugen af nanoprobes som guld, sølv, silica eller jernoxid nanopartikler som påvisning reagenser i bioanalytisk assays kan aktivere høj følsomhed og bekvemt kolorimetriske udlæsning. Høje tætheder af nanopartikler skal dog typisk til påvisning. De tilgængelige syntese-baserede enhancement protokoller er enten begrænset til guld og sølv nanopartikler eller stole på præcis enzymatisk styring og optimering. Vi præsenterer her, en protokol for at forbedre de kolorimetriske udlæsning af guld, sølv, silica og jern oxid nanoprobes. Det blev observeret, at de kolorimetriske signal kan forbedres ved op til en 10000-fold faktor. Grundlaget for sådanne signal enhancement strategier er kemisk reduktion af Au3 + til Au0. Der er flere kemiske reaktioner, der muliggør reduktion af Au3 + til Au0. I protokollen, gods buffere og H2O2 bruges og det er muligt at favorisere aflejring af Au0 på overfladen af eksisterende nanoprobes, på bekostning af dannelsen af nye guld nanopartikler. Protokollen består af inkubation af microarray med en løsning bestående af chloroauric syre og H2O2 i 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre pH 6 buffer efter nanoprobe-baseret detektion assay. Ekstraudstyr løsning kan anvendes til papir og glas-baserede sensorer. Det kan desuden bruges i kommercielt tilgængelige immunassays som påvist ved anvendelse af metoden til en kommerciel allergen microarray. Signal udvikling kræver mindre end 5 min af inkubationen med ekstraudstyr løsning og udlæsningen kan vurderes ved blotte øje eller low-end billede erhvervelse enheder som en tabel-top scanner eller et digitalt kamera.
Brugen af nanomaterialer såsom guld nanopartikler (AuNPs) eller jernoxid nanopartikler (IONPs) har tilladt programmerne i biosensing med forbedret følsomhed og alsidighed. 1 overfloden af metoder udviklet til udsmykning af overfladen af nanopartikler med forskellige ligander, at drage fordel af deres høje overflade til volumen-forholdet, har aktiveret design af sensorer med forbedret følsomhed. 2 alligevel, en biosensing værktøj er afhængig af antallet af nanoprobes kræves for at opnå en påviselig signal. For eksempel, i tilfælde af 40 nm AuNPs, at erhverve en signal gennem UV-vis spektroskopi, ca 90 × 106 nanoprobes er påkrævet for at registrere effektivt mål af interesse. 3 denne nanoprobe tæthed begrænsning kan omgås ved hjælp af signal forstærkning. Sådanne strategier4 kan være baseret på interparticle sammenlægning eller det bymæssige område, hvor tætheden af indledende nanoprobes er øget ved at akkumulere et andet sæt af nanoprobes ved først. 5 en mangedobling af nanopartikler i en given situation på en sensoren overfladen giver visual eller UV-vis signal erhvervelse. Dog vil følsomheden af analysen i sagens natur knyttet til målretning kapaciteten af det andet sæt af nanopartikler mod det første sæt af nanoprobes. Andre strategier stole på farvning af enten guld og sølv nanoprobes. 6 , 7 farvning opnås gennem reduktion af sølv ioner på overfladen af nanopartikler, gør det muligt for en visuel eller UV-vis-detektion. 8 disse metoder øge signal af eksisterende guld eller sølv nanoprobes af forstærket overflade resonans plasmon signal, ikke afhængigt af sekundære målretning begivenheder som i interparticle byområdet metoder. Sølv farvning metoder er dog kun indberettet med brug af guld eller sølv nanoprobes. 8 , 9
I 2005, Zayats mfl. 10 rapporteret reduktion af Au-ioner på overfladen af guld nanoprobes at øge overflade plasmon resonans signal. I dette enzym-afhængige arbejde, blev hydrogenperoxid genereret af glucose stavbakterier katalyse og sammen med cetyltrimethylammonium chlorid tilladt en reduktion af chloroauric syre.
For nylig Wang mfl. rapporteret en enhancement metode hvor en guld lag er produceret på overfladen af eksisterende nanoprobes. 11 disse udvidede nanoprobes vises peroxidase-lignende katalytiske aktivitet mod underlaget 3 ‘, 5, 5 ‘-tetramethylbenzidine (TMB) aktivering visualisering af en lys blå farve af blotte øje.
Stevens et al. rapporterede om udviklingen af en plasmonic ELISA-baseret analyse. 12 efter påvisning af en prostata-specifikt antigen (PSA) gennem en traditionel ELISA strategi, en sekundær antistof mærket med katalase blev inkuberet med sensoren efter som sensoren blev nedsænket i en oploesning indeholdende hydrogenperoxid og chloroauric syre. Den sekundære katalase modificerede antistof (positive resultat) ville fremme forbruget af hydrogenperoxid, aftagende chloroauric syre reduktion og eftergivende kvasi sfæriske monodispersed AuNPs med en rød farve. Fravær af katalase modificerede antistof (negativt) tilladt hydrogenperoxid koncentration at forblive intakt, således at fremme hurtig chloroauric reduktion og eftergivende AuNPs med dårligt defineret morfologier ansvarlig for en blå/lilla farve . Koncentrationen af hydrogenperoxid, bestemmes af aktiviteten af katalase, viste sig at være korreleret til koncentrationen af analysanden af interesse. Behovet for en katalase modificerede sekundær antistof og kontrol af betingelserne for den katalytiske aktivitet er to faktorer, der hindrer universel anvendelse af denne metode. Derudover kan dannelsen af guld klynger, uafhængigt af de eksisterende AuNPs, indføre baggrund støjproblemer forstærkning strategi.
De ovennævnte teknikker, som også flere andre13,14,15, har gjort det muligt for nanoprobe-baserede biosensorer at opnå detektionsgrænser på lige fod med traditionelle teknikker.
Her, en roman guld enhancement metode er demonstreret, hvor signalet fra en eksisterende nanoprobe forstærkes af forstærkende eller indfører en overflade plasmon resonans signal. Efter påvisning er udført med brug af guld, sølv, silica eller jernoxid nanopartikler, sensoren er tilladt at udruge med en opløsning af en blanding af hydrogenperoxid og chloroauric syre i 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) pH 6 buffer. Koncentrationerne af komponenterne i enhancement løsning var optimeret til at favorisere aflejring af Au0 på overfladen af eksisterende nanoprobes. Alle studeret nanoprobe typer, dvs. AuNPs, sølv nanopartikler (AgNPs), silica nanopartikler (SiNPs) og IONPs, dannelsen af en dårligt defineret lag givet eller augmented spredning af lyset, hvilket resulterede i en påviselig eller øget synligt signal. En signal stigning med en 100-fold forstærkning faktor var opnået for nanoprobes i papir og glas-baserede microarrays og processen tager mindre end 5 min. at anskaffe et signal. Signal erhvervelse kunne gøres ved at blotte øje, UV-vis spektroskopi eller imaging low-end værktøjer som et digitalt kamera eller en tabel-top scanner. Derudover blev det påvist at dette ekstraudstyr protokol kan anvendes let og et kommercielt tilgængelige allergi diagnostiske assay uden at kræve bestemte optimering.
I øjeblikket, signal forbedring teknikker til assays med nanoprobe-baseret detektion er enten enzym-baserede12, kræver et andet sæt af nanopartikler til target detection nanoprobes21 eller, for så vidt angår farvning teknikker, er begrænset til Brug af AuNPs eller AgNPs som påvisning sonder. 22 her, en enkel, hurtig og enzym-fri metode er beskrevet for signal forstærkning af nanoprobe opdagelse-baseret assays. Med denne metode, det var muligt at øge kolorimetriske signalet leveres af 4 typer af nanoprobes: AuNPs, AgNPs, IONPs og SiNPs.
Den observerede forstærkning faktor for hvert sæt af nanoprobes var af 100, bortset fra SiNPs hvor kvantificering af ekstraudstyr faktor ikke var muligt skyldes manglende før ekstraudstyr signaler. Dette enhancement faktor antyder, at effektiviteten af protokollen er ens på tværs af alle typer af nanoprobes. Desuden, når enhancement protokol blev udført på et papir hvor en fortyndingsrække af stock AuNPs suspension blev trykt, blev det observeret en 10000-fold forstærkning faktor. Tidligere ekstraudstyr, de synlige steder med det laveste antal AuNPs var hvor ca 10000 nanopartikler blev trykt, efter enhancement steder husly mindre end 10 nanopartikler blev synlig. 20
Betingelserne for ekstraudstyr protokol her præsenteret har tilladt, at drage fordel af en reduktion af Au3 + til Au0 til signal forbedring, samtidig med at baggrundsstøjen til et minimum. Ekstraudstyret kan udføres lige efter analysen udføres såvel som på microarrays, der har været gemt for op til flere måneder efter analysen blev udført. Ekstraudstyr løsning består af en 1:1 blanding af løsning 1 og løsning 2. Begge løsninger kan tidligere blandet eller direkte blandet når pipetted på microarray. Forskellen mellem pre blanding eller direkte blanding påvirker kun holdbarheden af ekstraudstyr løsning. Når færdigblandede holdbarhed er 5-7 dage at stige til 30-45 dage hvis ikke pre blandet.
Yderligere analyse af resultaterne har vist, at metoden enhancement ikke forstyrrer den kvantitative analyse af biosensor. En lineær korrelation mellem intensiteten observeret og koncentrationen af analysanden blev opretholdt (tabel 1). Oplysninger indhentet for 4 præ karakteriseret kliniske prøver ved hjælp af glas-baserede allergen komponent microarray immunassay, med standard fluorescens påvisning og kolorimetrisk detektion, viste en god overensstemmelse mellem de to metoder til påvisning. Sammenligning af gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI) og den gennemsnitlige kolorimetriske intensitet (MCI), en gennemsnit R2 = 0,79 +/-0,08 blev opnået, når dataene er 10-logget på begge akser. Dette eksperiment viste, at metoden ekstraudstyr kan anvendes på en kommerciel kit, hvis det bruger nanoprobes til påvisning eller kan tilpasses til nanoprobe-baseret detektion.
Ekstraudstyr metode effektivitet er afhængig af to vigtige aspekter. Det er vigtigt at sikre, at blandingen af løsning 1 og løsning 2 er homogen. Uden en homogen blanding, vil sensoren være i kontakt med brøkdele af ekstraudstyr løsning hvor løsning 1 eller 2 er fremherskende i forhold til den anden. Det vil reducere effektiviteten af reduktion af Au3 + til Au0, dermed ødelægger effektiviteten af ekstraudstyret. Det er også vigtigt at have hele området af interesse af microarray kontakt med ekstraudstyr løsning under inkubationstiden.
For at opnå ultrasensitive forbedring af et signal, vil en længere Inkubationstiden (ca. 5 min.) med ekstraudstyr løsning være påkrævet. For at undgå udvikling af baggrundsstøj, der kan forstyrre signalet erhvervelse, bør microarray overfladen være tidligere blokeret (fx BSA, PIND) at forhindre hurtig uspecifik aflejring af Au0 og deraf følgende dannelsen af en guld lag.
En begrænsning til metoden ekstraudstyr er iboende effekten af analysen. Analysen kræver, at have negativ og positiv kontrol at sikre, at signalet enhancement overholdes kan tilskrives sand-positive resultater. Hvis der er en ikke-specifik interaktion af nanoprobes med mål, signaler erhvervet efter ekstraudstyr ikke vil være gyldig.
Andre forbedring teknikker er baseret på enten nanopartikel sammenlægning eller farvning af nanopartikler med et materiale, der giver forbedret signal erhvervelse. Ved at fremme indsamlingen af antallet af nanopartikler på webstedet påvisning, signal erhvervelse bliver muligt enten visuelt eller UV-Vis målinger. 5 disse signal forbedring teknikker stole på en to-trins detektionssystem, den første påvisning af analysand af interesse og et andet trin, hvor journalisten er forpligtet til at binde sig til den oprindelige registrering konstruktion. Sådanne strategier mangler universalitet på grund af kravet om specifikke enhancement protokol optimering for hver type af assay.
Farvning forbedring teknikker, såsom sølvfarvning, meget ligesom protokollen her præsenteret, tillader en direkte forbedring af signal detection konstruktioner. I modsætning til den protokol, der er vist her, har sølv farvning imidlertid kun været vist skal anvendes til enten AuNPs eller AgNPs. 6 , 7 , 8 , 9
Anvendeligheden af denne metode kunne sandsynligvis span nogen assay, der bruger AuNPs, AgNPs, IONPs eller SiNPs som registrering agenter. Yderligere arbejde udføres til at undersøge anvendelsen af metoden i sensorer bestående af andre materialer.
The authors have nothing to disclose.
Støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013)-ERC Grant aftale nr. 615458, det svenske Forskningsråd og Pronova excellence center for protein teknologi (VINNOVA – svensk Statslige agentur for Innovation Systems) anerkendes taknemmeligt.
Chloroauric acid | Sigma-Aldrich | 254169 ALDRICH | |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S4641 SIGMA-ALDRICH | |
Dimethylaminoborane | Sigma-Aldrich | 476668 ALDRICH | |
Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma-Aldrich | 416037 ALDRICH | |
Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 204390 ALDRICH | |
100 nm magnetic nanoparticles | Ademtech | 021111 | |
50 nm silica nanoparticles | Corposcular | 140510-10 | |
COOH-PEG-SH | RAPP Polymere | 135000-4-32 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.06462 EMD MILLIPORE | |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 SIGMA | |
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 ALDRICH | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 95313 SIGMA-ALDRICH | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 SIGMA | |
IgG antibody | Abcam | ||
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 ALDRICH | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 SIGMA-ALDRICH | |
Bovine serum albumin | VWR | 422351S | |
Protein G | Thermo Scientific | 21193 | |
Nitrocellulose paper membrane | Whatman | 10402096 | |
Nanoplotter 2.1 robotic printer | GeSIM | ||
Filter holder | Merck | XX3001200 | |
PhD2000 Ultrasyring pump | Harvard | ||
Flatbed scanner CannonScan 9000F Mark II | Cannon | ||
Anti-human IgE antibody-modified AuNPs | Thermofisher | ||
Laser scanning LuxScan 10/K | Capital Bio | ||
Table-top scanner Image Scanner Epson Expression 1600 pro | Epson | ||
Glass slide ImmunoCAP ISAC sIgE 112 | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Fluorescent-conjugated anti-human IgE antibody | Thermofisher | 81-1011-01 | |
Phadia Microarray Image Analyzer MIA 1.2.4 | Thermofisher |