Målet med detta protokoll är att demonstrera den intra-prostatahyperplasi injektionen av prostatacancerceller, med efterföljande kastrering. Ortotop prekliniska modeller av androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer är kritiska att studera sjukdomen i samband med en kliniskt relevant tumör närmiljön och en immunkompetenta värd.
Ortotop tumör modellering är ett värdefullt verktyg för pre-klinisk prostatacancer forskning, eftersom det har flera fördelar över både subkutan och transgena genetiskt modifierade musmodeller. Till skillnad från subkutana tumörer innehåller ortotop tumörer mer kliniskt korrekta kärlsystemet, tumör närmiljön och Svaren till flera behandlingar. I kontrast till genetiskt modifierade musmodeller, ortotop modeller kan utföras med lägre kostnad och i mindre tid, innebär användning av mycket komplexa och heterogena mus eller mänskliga cancer cellinjer, snarare som en genetiska förändringar, och dessa cell rader kan vara genetiskt modifierade, sådan att uttrycka imaging agenter. Här presenterar vi ett protokoll till kirurgiskt injicera en luciferas – och mCherry-uttryckande murina prostatacancer cell fodrar i den främre prostata loben av möss. Dessa möss utvecklat ortotop tumörer som var icke-invasivt övervakade i vivo och ytterligare analyseras för tumör volym, vikt, mus överlevnad och immun infiltration. Ortotop tumör-bärande möss var dessutom kirurgiskt kastrerade, vilket leder till omedelbar tumörregression och efterföljande upprepning, som representerar kastrationsresistent prostatacancer. Även om tekniska skicklighet krävs för att utföra proceduren, är denna syngena ortotop modell av både androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer till stor nytta för alla utredare i fältet.
Prostatacancer bedöms ha den högsta incidensen (161,360 män) och orsakar de tredje-mest manliga cancer dödsfall (84,590 män) i 20171. Vid diagnos, prostatacancertumörer androgen-beroende, och behandlas med kirurgisk prostatektomi, strålbehandling eller androgen deprivationsterapi (ADT), men varje behandling är associerad med flera större komorbiditeter och komplikationer2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. Trots tumörregression efter ADT, nästan alla tumörer återkommer som kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). I detta skede, godkända behandlingar inkluderar docetaxel, Sipuleucel-T immunterapi, och antiandrogen små molekyler enzalutamid och abirateron, men ingen enskild terapi ger en överlevnadsfördel av mer än 5,2 månader11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. män i alla stadier av prostatacancer måste därför både förbättrade behandlingsalternativ och hantering av komorbiditeter, modellering är avgörande för vilken optimal pre-klinisk sjukdom.
Med korrekta förfarandet, kan prostata cancer cellinjer vara kirurgiskt ingjutit i murina prostatan, vilket leder till utveckling av både syngena eller xenogena ortotop tumörer. Ortotop tumör modellering är idealisk för alla tumör biologi och drog utvecklingsforskning, möjliggör tumörutveckling med en kliniskt representativa tumör närmiljön (TME). Tidigare studier har visat att subkutana (s.c.) tumörer har en förändrad tumör kärlsystemet, vilket leder till differential och mindre kliniskt korrekta Svaren till anti-angiogena terapier18,19. Dessutom observerat flera studier ökad eller minskad effekt av flera kemoterapeutika vid behandling av samma cell linje, beroende på om det var ges s.c. eller orthotopically, den senare som bäst representerade vad som syns i mänskliga cancer20,21,22. Dessutom gjorde endast i en ortotop modell av tjocktarmscancer, men inte i s.c. modellen, tumörer producerar de rätta nedbrytningsvägar enzymerna som är nödvändiga att inducera metastaser23. Slutligen immunterapier fortsätter att dyka upp i spetsen för cancerbehandling, och särskilt eftersom de har ännu att ge betydande fördelar för prostatacancer24,25, syngena prekliniska modeller med korrekt TME och dränerande lymfkörtlar i immunkompetenta värdar är kritiska.
Det finns många faktorer som är ansvariga för dessa inkonsekventa resultat baserat på tumören webbplats. Med en annan TME, cancerceller utsätts för olika vävnadsspecifika endotel och förändrad angiogenes, vilket påverkar tumören utveckling26,27. Ortotop tumörer med den rätta TME möjliggör kliniskt relevanta drug delivery, hypoxisk villkor och utvärdering av anti-angiogena terapier28. Medan genetiskt modifierade modeller (ädelstenar) innehåller en korrekt TME, de kräver långa tider för avel, hög kostnad och är ofta baserat på manipulationer av enstaka eller några gener utslagen eller i ökad utsträckning bortom kliniskt relevanta nivåer. De mänskliga eller murina prostata cancer cellinjer som används i ortotop tumörer, som mänskliga tumörer, är däremot mycket mer genetiskt komplexa både inom enstaka celler och Visa heterogenitet mellan celler29,30. Också till skillnad från pärlor, ortotop cancer cellinjer kan vara konstruerad för att uttrycka avbildningsmetoder eller ökade eller minskade nivåer av andra molekyler av intresse, och in vitro- och in-vivo experimentella resultat kan jämföras direkt. Ortotop tumörer kan också bildas från primära patientderiverade celler. Vi rapporterar här, metoden för att utföra intra-prostatahyperplasi injektioner av prostatacancerceller som bildar ortotop androgen-beroende tumörer, och, efter kastrering, återkomma som ortotop CRPC.
I detta manuskript redogöra vi för protokollet om du vill utföra kirurgiska intra-prostatic cancer cell injektioner. Vi utnyttjas av androgen-beroende och MYC –överuttryck (MYC överuttryck syns upp till 80-90% av mänsklig prostatacancer39) murina prostatacancer cell fodrar, Myc-CaP, ursprungligen isolerats från Hi-Myc mus32 ,33. Denna cellinje var stabilt sensorik för att uttrycka både luciferas och mCherry, för icke-invasiv i vivo självlysande och fluorescerande tumör imaging, respektive. Ytterligare, kirurgisk kastrering utfördes också efter androgen-beroende tumörutveckling, leder till tumörregression och efterföljande upprepning. Därför, vi tillhandahåller detaljer till modell både ortotop androgen-beroende prostatacancer och CRPC under en immunkompetenta värd.
MYC-CaP celler injicerades i den främre prostata loben av möss. Mus prostatan består av den främre, ventrala och dorsolaterala prostata loberna och mänskliga prostatan består av en perifer zon, övergångsbestämmelser zon och centrala zonen inom en enda LOB-40. Medan tidigare studier har anatomiskt och histologiskt jämfört dorsolaterala mus LOB till människans perifera zonen, platsen för majoriteten av prostatacancer41, och främre mus LOB till människans centrala zonen42, 43, mer nyligen och heltäckande analys har visat att den främre loben och dorsolaterala LOB visar närbesläktade gen uttrycksmönster, jämfört med den ventrala loben. 44 vidare prostatacancer utveckling har observerats i den främre loben av pärlor40, och, för intra-prostatahyperplasi förfarandet, den främre loben tillåter för injektion av den nödvändiga mängden cancer cell lösning med minimal läckage och variabilitet.
Med hjälp av s.c. och transgena pärla cancer modeller har flera brister och begränsningar. S.c. tumörer vuxit i en konstgjord TME har differential Svaren till kemoterapier, i motsats till båda ortotop tumörer från samma cell linjer och mänskliga sjukdomar20,21,22. Detta kan bero på den förändrade vaskulatur av s.c. tumörer, som exemplifieras av deras differentiell svar på anti-angiogena terapi18,19. Tvärtom ortotop tumörer utvecklas med en ordentlig TME, dränerande lymfkörtlar och kärlsystemet och kan utföras med murin cellinjer, därmed också möjliggör analys av tumör immunologi och svar på immunterapi.
Transgena pärlor utveckla tumörer med en ordentlig TME i en immunkompetenta värd, men dessa modeller förenklingarna vanligtvis mänskliga cancer genom att utveckla tumörer med enstaka eller några genetiska förändringar29. En analys av Myc-CaP och andra prostata cancer cellinjer visade att de innehöll mycket större somatiska kopia antalet ombyggnader och kromosomala förändringar än tumörer från Hi-Myc möss och andra pärlor som de var härledda29. Ytterligare, pärlor är begränsade av den ökade kostnaden och tidsåtgången för möss avel för att utföra experiment av tillräcklig effekt. Ortotop tumör modellering kan övervinna dessa begränsningar. Mänskliga och murina prostata cancer cellinjer innehåller många genetiska förändringar som är relevanta för mänskliga sjukdomar29, och, som human cancer, visar också stor heterogenitet mellan enskilda celler30. Ortotop murina syngena tumörer möjliggör immunologiska analyser, medan ortotop xenogena tumörer möjliggör analyser av therapeutics på mänskliga celler. Slutligen, till skillnad från med pärlor, cell linjer kan ändras innan injektion, vilket möjliggör uttryck för självlysande eller fluorescerande imaging molekyler för att övervaka tumörtillväxt, normalisera tumör börda bland experimentella grupper, övervaka svar på behandling, och Följ tumörregression och CRPC återkommande efter kirurgisk kastrering.
Kritiska steg i detta protokoll inkluderar lokalisering och externalisera de seminal vesikel och bifogade främre prostata loben utan skadar andra vävnader eller punktera seminal vesikel, utför en framgångsrik intra-prostatahyperplasi injektion av de 30 µL av cell suspension utan läckage, och korrekt insamling läckage för att förhindra icke-ortotop tumörutveckling i hela buken. Den största begränsningen av intra-prostatahyperplasi injektioner är att uppnå teknisk skicklighet krävs för att minimera tumör variabiliteten mellan möss. Detta är särskilt viktigt för modellering CRPC, som har extra variabel av kirurgisk kastrering. Intra-prostatically injiceras och kastrerade möss måste också följas noggrant för återhämtning och biverkningar, som har genomgått två större överlevnad operationer. En annan begränsning är tiden för varje intra-prostatahyperplasi injektion. Detta kan reduceras till som låg som 20 min och kirurgen assistent kan förbereda nästa musen som nuvarande musen att sys. Slutligen är ortotop Myc-CaP tumörer aggressiva, snabbt växande tumörer som når slutpunkten överlevnad i cirka 46 dagar (och så tidigt som 35 dagar) på grund av den primära tumören massa. Studier som kräver långsammare tumörutveckling eller långsiktiga behandlingar bör optimeras empiriskt för den första injektionen cell sammanräkning och behandling regimen. I motsats till begränsningarna av s.c. tumörer och pärlor, alla av ovanstående begränsningar av ortotop tumör modellen kan övervinnas, och ytterligare ändringar av protokollet kan göras utifrån individuella experimentella behov.
Som ortotop tumör modell innebär användning av in vitro-hanteras celler, dessa celler kan ändras beroende på studien behov. Här, ändrade vi dessa celler för att stabilt uttrycka luciferas och mCherry för i vivo tumör övervakning. Vi har även genomfört en CRISPR-Cas9 knockout av tumörsuppressor PTEN, att generera en mer aggressiv, kliniskt relevanta cellinje som växer snabbare som ortotop tumörer (manuskript i review). Fördelar med ortotop tumör modellen, möjlighet att studera både androgen-beroende prostatacancer CRPC och potential att uttrycka avbildningsmetoder eller knockdown eller overexpress Välj gener, fungerar detta protokoll som en värdefull resurs för alla prostatacancer-forskning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av National Institutes of Health bidrag till Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Veera ketchupin (NCI R01 CA167966, NCI R01 CA123484, NCI P50 CA180995) och Jonathan Anker (NCI F30 CA203472).
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |