دمج بيريسيتيس حبة غشائي خلية نبتت الإنزيم
Summary
يعرض البروتوكول هذا الاعتداء حبة رواية في المختبر أن أكثر نماذج مناسب عملية في فيفو تنتشر الأوعية بإدراج بيريسيتيس. ويتيح هذا التعديل المقايسة حبة الخص أكثر إخلاص الغيروية التفاعلات الخلوية بين خلايا بطانية والخلايا الجدارية التي حاسمة بالنسبة للأوعية.
Abstract
الأوعية نمو الأوعية الجديدة من المفرج الموجودة من قبل وهو عنصرا هاما في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك امبريوجينيسيس والتنمية والتئام الجروح، ونمو الورم وورم خبيث، وأمراض العين والقلب والأوعية الدموية. نماذج فعالة في المختبر أن الخص بيولوجيا تولد الأوعية ضرورية لدراسة هذه العملية على نحو ملائم وتحديد آليات التنظيم التي يمكن أن تكون مستهدفة في نهاية المطاف لاستراتيجيات علاجية جديدة. والرزن الأوعية حبة قد ثبت سابقا أن الخص مراحل متعددة تنتشر غشائي في المختبر. ومع ذلك، حد من هذا التحليل الافتقار إلى من بطانية – تعمل الخلية الجدارية التفاعلات، التي مفتاح لتنظيم خلايا غشائي الجزيئية والمظهرية في فيفو. البروتوكول هنا يقدم منهجية لدمج الخلايا الجدارية في مقايسة الأوعية حبة ويوضح ارتباط ضيق غشائي الخلايا وبيريسيتيس أثناء تبرعم في المختبر. تفاصيل البروتوكول أيضا منهجية لإسكات فعالة من الجينات المستهدفة باستخدام siRNA في خلايا بطانية للدراسات الميكانيكية. وإجمالا، يوفر هذا البروتوكول في المختبر تحليل أن من الأنسب نماذج أنواع الخلايا المختلفة المشاركة في تنتشر الأوعية، ويوفر منبرا أكثر فسيولوجيا ذات صلة لتقييم العلاج واكتشاف رواية آليات التنظيم تولد الأوعية.
Introduction
الأوعية حيوية embryogenesis المناسبة والتئام الجروح، وكما أنها تلعب أدواراً رئيسية في العديد من الأمراض بما في ذلك التقدم1 والشريان التاجي مرض السرطان. 2 , 3 وجود فهم أفضل لكيفية حدوث عملية تولد الأوعية خلال التطور الطبيعي، وكيف يتم إعادة تنشيطها في سياقات باثولوجي، أمر بالغ الأهمية لتطوير الرواية، والعلاجات الفعالة. نماذج المؤمنين في المختبر أن الخص المراحل الهامة وأنواع الخلايا المعنية في الأوعية في فيفو ضرورية للسماح للباحثين أفضل وصف الآليات الجزيئية التي يقود الأوعية وجعل الاكتشافات رواية في لائحة بطانية.
ناكاتسو وهيوز الأمثل مقايسة حبة تبرعم التي قد أظهروا يخضع للعديد من مراحل معروفة تنتشر الأوعية. 4 , 5 غرض الطريقة المعروضة هنا البناء على التحليل الأمثل ناكاتسو وهيوز من خلال دمج بيريكتييس في التحليل، حتى يمكن إدراج أدوار باراكريني وجوكستراكريني من الخلايا الجدارية في الخلية البطانية تنتشر في دراسات الرواية تولد الأوعية. بيريسيتيس هي الخلايا الجدارية التي تتحدد بدورها كالخلايا التي تحافظ على إغلاق الاتصال المادي مع خلايا غشائي بسبب المضمنة في غشاء الطابق السفلي والأوعية الدموية. 6 بيريسيتيس وخلايا بطانية مزاولة المعقدة عبر الحديث عن طريق إشارات المسارات بما في ذلك الشق الإشارات، إنج-Tie2، PDGFRβ، TGFRβ، وغيرها الكثير. 7 , 8 الماوس نماذج ناقصة في هذه المسارات مما يشير إلى إثبات التغطية بيريسيتي الفقيرة النامية المفرج في امبريوجينيسيس، مما أدى إلى إعادة عرض الأوعية الدموية الفقيرة والمفرج المختلة وظيفيا. 7 بالإضافة إلى ذلك، دور بيريسيتيس في الأوعية باثولوجي مهم ولكن في كثير من الأحيان تحت تقدير. على سبيل المثال، ميزة فريدة من نوعها للورم المفرج أن السفن التي غير ناضجة أكثر، راشح، ومختلة بسبب التغطية بيريسيتي الفقيرة. 9 أنه قد اقترح أن وجود أو عدم وجود بيريسيتيس هائلة تؤثر النمط الظاهري لورم الأوعية الدموية وهو وسيط هام للردود على الأوعية والعلاجات انتيتومور. 9 وهكذا، بما في ذلك دور بيريسيتيس في فحوصات في المختبر مفتاح لالتقاط أكثر تماما الآليات الهامة لتنظيم بطانية.
على الرغم من أن هناك العديد من الاختبارات في المختبر و السابقين فيفو المستخدمة حاليا لدراسة الأوعية، هناك أوجه قصور للنظر في كل منها. بعضها، مثل انتشار بطانية وفحوصات الهجرة بطانية، يتم تبسيط مفرط والتركيز على دالة بطانية واحدة في بيئة معزولة في زراعة الأنسجة من البلاستيك. 10 فحوصات أخرى تحدث في إعداد 3 الأبعاد (3D) أكثر، مثل المقايسة تشكيل أنبوب ماتريجيل،10 ولكن هذه الاختبارات لا يزال المفرطة والتركيز أكثر على قدرة خلايا بطانية ترحيل ونموذج حيثياته الأوعية الدموية الهياكل، خلافا لتنتشر من المفرج الموجودة من قبل. وعلاوة على ذلك، أي من هذه الاختبارات تتضمن أنواع الخلايا الجدارية. هناك السابقين فيفو نماذج مثل المقايسة الشريان الاورطي الحلبة التي تدمج بيريسيتيس الموجودة في الجهاز المضيف، ولكن التلاعب بالجينات لهذه النماذج تحديا أكبر بكثير نظراً لضرورة توليد نماذج الماوس الضربة القاضية أو المحورة وراثيا مسارات للفائدة. حبة نبتت المقايسة مثاليا نظراً لأنها نماذج تنتشر بطانية والانتشار والهجرة وحتى تشكيل ملامسة والتجويف في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. 4 المقايسة إخلاص تسمح بتقييم آليا إلى العديد من المراحل المختلفة لتنتشر، في حين لا يزال يسمح لمباشرة التعديل الوراثي لخلايا بطانية أو بيريسيتيس في أجواء أكثر الخاضعة للرقابة. الجلطات فيبرينوجين يحتوي على الخرز تبرعم يمكن بسهولة الثابتة، الملون، وتصويرها في مراحل مختلفة من نبتت؛ يمكن أيضا أن توضع هذه براعم في غرفة تصوير الحي القيام بالتصوير في الوقت الحقيقي لتنتشر. المنهجية المقدمة هنا مثالية لدراسة الآليات الأساسية لتولد الأوعية عن طريق في عمق فينوتيبينج وتحليل دقيق للمسارات تفعيلها خلال الأوعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة لوصف مراحل معقدة والتفاعلات الخلوية الغيروية تنتشر الأوعية عن طريق تمكين الباحث توظيف النهج الوراثية والتصوير إجراء تحقيقات شاملة آليا. عند القيام التحليل، من الضروري أن كفاءة طلاء غشائي من الخرز تجري خلال حبة الخطوات الانفعالات. سوف يتم طلاء بطانية الفقراء و?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور فيكتوريا بوتش وباوتشر جوشوا لإجراء مناقشات مفيدة وإسداء المشورة بشأن تحسين حبة القياسية تنتشر في ظروف المقايسة ومقايسة تبرعم تلطيخ البروتوكول. S.H.A. تدعمها جزئيا بمنحه من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة تحت جائزة 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
Referências
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
