Indarbejde Pericytes i en endotel celle perle spiring Assay
Summary
Denne protokol præsenterer en roman i vitro perle assay, mere passende modeller proces i vivo spiring angiogenese ved at indarbejde pericytes. Denne ændring gør det muligt for perle assay til mere trofast sammenfatte Heterotypiske cellulære vekselvirkninger mellem endotelceller og vægmaleri celler, der er kritiske for angiogenese.
Abstract
Angiogenese er vækst af nye fartøjer fra allerede eksisterende vaskulatur og er en vigtig komponent i mange biologiske processer, herunder embryogenese og udvikling, sårheling, tumorvækst og metastase, og okulær og hjerte-kar-sygdomme. Effektiv in vitro- modeller, at sammenfatte biologi af angiogenese er behov for passende studere denne proces og identificere ordninger for regulering, der i sidste ende kan målrettes til romanen terapeutiske strategier. Perle angiogenese assay har tidligere vist sig for at sammenfatte de flere stadier i endothelial spiring in vitro-. Imidlertid en begrænsning i denne analyse er en mangel i endothelial-vægmaleri celle interaktioner, , som er nøglen til den molekylære og fænotypiske forordning i endothelial celle funktion i vivo. Protokol her præsenterer en metodologi til indbygning af vægmaleri celler i perle angiogenese assay og demonstrerer en stram association i endothelial celler og pericytes under spirende in vitro. Protokollen også detaljer en metode til effektiv hæmning af target gener med siRNA i endothelial celler til Mekanistiske undersøgelser. Helt, denne protokol giver et in vitro- forsøg, der mere passende modeller af forskellige celletyper involveret i spiring angiogenese, og giver en mere fysiologisk relevante platform for terapeutisk vurdering og roman opdagelse af mekanismer af angiogenese forordning.
Introduction
Angiogenese er afgørende for passende embryogenese og sårheling, og det også spiller vigtige roller i talrige sygdomme herunder kræft progression1 og koronar arterie sygdom. 2 , 3 at have en bedre forståelse af hvordan angiogenese opstår under normale udvikling, og hvordan det er genaktiveret i patologisk sammenhænge, er afgørende for udviklingen af roman, effektiv terapi. Trofaste in vitro- modeller, at sammenfatte de vigtige etaper og celletyper involveret i angiogenese i vivo er nødvendige for at give forskere bedre karakterisere de molekylære mekanismer kørsel angiogenese og gøre nye opdagelser i endothelial forordning.
Nakatsu og Hughes har optimeret en spirende perle assay, som de har udvist, gennemgår de mange kendte stadier af spiring angiogenese. 4 , 5 formålet med metoden præsenteres her er at bygge videre på analysen optimeret ved Nakatsu og Hughes ved at indarbejde perictyes i analysen, således at rollerne paracrine og juxtracrine af vægmaleri celler i endothelial celle spiring kan integreres i Roman angiogenese undersøgelser. Pericytes er vægmaleri celler, der er defineret af deres rolle som celler, der opretholder tæt fysisk kontakt med endotelceller på grund af deres indlejret i den vaskulære basalmembranen. 6 Pericytes og endotelceller deltage i komplekse cross-talk via signalering veje herunder Notch signalering, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ og mange andre. 7 , 8 musemodeller mangelfuld i disse signaling veje vise dårlige pericyte dækning for at udvikle Vaskulaturen i embryogenese, fører til dårlig vaskulære remodellering og dysfunktionelle Vaskulaturen. 7 Derudover pericytes i patologisk angiogenese rolle er vigtig, men ofte under-værdsat. For eksempel er en unik feature i tumor Vaskulaturen at fartøjerne er mere umodne, utæt og dysfunktionelle på grund af dårlige pericyte dækning. 9 det er blevet foreslået, at tilstedeværelsen eller fraværet af pericytes dramatisk påvirker Fænotypen af tumor blodkar og er en vigtig mediator af svar til antiangiogenic og antitumor behandlingsformer. 9 således, herunder rollen, som pericytes i in vitro- assays er nøglen til mere helt fange de vigtige mekanismer i endothelial forordning.
Selvom der er mange i vitro og ex vivo assays i øjeblikket ansat til at studere angiogenese, er der mangler i hver. Nogle, såsom endotel spredning og endotel migration assays, er alt for forenklet og fokusere på én endotelfunktion i isolerede omgivelser på vævskultur plast. 10 andre assays forekomme i en mere 3-dimensionelle (3D) indstilling, såsom Matrigel tube dannelse assay,10 men disse assays er stadig forsimplede og fokusere mere på muligheden for i endothelial celler til at migrere og danne de novo vaskulære strukturer, i modsætning til spiring fra allerede eksisterende Vaskulaturen. Desuden, ingen af disse assays indarbejde vægmaleri celletyper. Der er ex vivo modeller såsom ring aorta assay der indarbejde pericytes stede i host-orgel, men genmanipulation af disse modeller er meget mere udfordrende på grund af nødvendigheden af at skabe knockout eller transgene musemodeller for den veje af interesse. Perle spiring assay er ideelt, fordi det modeller endotel spiring, spredning, migration og endda anastomose og lumen dannelse i en 3D matrix. 4 analysen trofast giver mulighed for mekanistisk vurdering af de mange forskellige stadier af spiring, mens det stadig tillader for direkte gensplejsning i endothelial celler eller pericytes i en mere kontrolleret indstilling. Fibrin blodpropper indeholdende de spirende perler kan nemt fast, farves, og afbildet på forskellige stadier af spiring; disse spirer kan også placeres i et live imaging kammer til at udføre real-time imaging af spiring. Den metode, der præsenteres her er ideel til at studere grundlæggende mekanismer af angiogenese gennem i dybde fænotyper og grundig analyse af de veje, aktiveret under angiogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol udgør en metode til at karakterisere de komplekse stadier og Heterotypiske cellulære vekselvirkninger mellem spiring angiogenese af gør det muligt for forskeren at ansætte genetiske og billedbehandling tilgange til grundig Mekanistiske undersøgelser. Når du udfører analysen, er det vigtigt, at effektiv endotel belægning af perlerne finder sted under perlen agitation trin. Dårlig endotel belægning vil blive gjort tydeligt, hvis perlerne ikke synes at have en golf bold-lignende ru overflade næste …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Drs. Victoria Bautch og Joshua Boucher for nyttige diskussioner og rådgivning om optimering af standard perle spiring assay betingelser og en spirende assay farvning protokol. S.H.A. var delvist understøttet af et tilskud fra National Institute of General Medical Sciences under tildele 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
Referências
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
