Este apresenta protocolo um grânulo de romance em vitro ensaio que mais apropriadamente modela o processo na vivo brotando angiogênese incorporando pericitos. Esta modificação permite que o ensaio de grânulo mais fielmente recapitular as interações heterotypic celulares entre células endoteliais e células murais que são críticas para a angiogênese.
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Artigo de método
Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Angiogênese é o crescimento de novos vasos da vasculatura pré-existentes e é um importante componente de muitos processos biológicos, incluindo a embriogênese e desenvolvimento, cicatrização de feridas, crescimento tumoral e metástase e doenças oculares e cardiovasculares. Eficaz em vitro modelos que recapitular a biologia da angiogênese são necessários apropriadamente estudar esse processo e identificar mecanismos de regulação que pode, finalmente, ser alvo de novas estratégias terapêuticas. O ensaio de angiogênese grânulo tem demonstrado anteriormente para recapitular os múltiplos estágios de germinação endotelial in vitro. No entanto, uma limitação deste teste é uma falta de endotelial – interações célula mural, , que são fundamentais para a regulação fenotípica e molecular da célula endotelial funcionam na vivo. O protocolo dado aqui apresenta uma metodologia para a incorporação de células murais o ensaio da angiogênese do grânulo e demonstra uma associação apertada de células endoteliais e pericitos durante a germinação em vitro. O protocolo detalha também uma metodologia para a eficaz silenciamento de genes-alvo usando siRNA em células endoteliais para estudos mecanicistas. No total, este protocolo fornece um ensaio em vitro que mais apropriadamente modela os tipos de célula diversos envolvidos na angiogênese de brotação e fornece uma plataforma mais fisiologicamente relevantes para avaliação terapêutica e romance descoberta de mecanismos de regulação de angiogênese.
Introdução
Angiogênese é vital para a embriogênese apropriado e cicatrização de feridas, e também desempenha papel chave em inúmeras doenças, incluindo câncer doença1 e artéria coronária de progressão. 2 , 3 ter uma melhor compreensão de como a angiogênese ocorre durante o desenvolvimento normal, e como ele é reativado em contextos patológicos, é crítico para o desenvolvimento do romance, terapêutica eficaz. Fiel em vitro modelos que recapitular as etapas importantes e tipos de células envolvidos na angiogênese na vivo são necessários para permitir que os pesquisadores para melho....
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Protocolo
Dia 1:
1. transiente transfecção de células endoteliais
- Se desejado, realizar uma transfecção transiente de humano Umbilical veia endoteliais células (HUVEC) usando oligonucleotídeos gene regulamentares (por exemplo, micro-RNAs ou RNA de interferência pequeno (siRNA)) e o reagente lipofectamine apropriado de acordo com instruções do fabricante.
Nota: Este protocolo também teve grande sucesso, realizando transfections reversos com sequências de siRNA personalizada e um reagente de transfeccao comercial (ver tabela de materiais). Os autores não testei outros protocolos de transfecção e reagentes com este....
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Resultados
Este protocolo permite uma associação apertada da dois célula tipos in vitro, e a presença dos pericitos complementa a ocorrência de germinação (figura 1A, B). O protocolo também permite eficaz silencioso (por exemplo, através da interferência do RNA) de um gene de interesse em um tipo de célula de interesse, tais como (VEGFA especificamente nas células endoteliais) ou PDGFRβ em pericitos7,.......
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Discussão
Este protocolo apresenta um método para caracterizar a fases complexas e interacções celulares heterotypic de brotação angiogênese, permitindo que o pesquisador empregar abordagens genéticas e da imagem latente para conduzir investigações mecanicistas minuciosos. Ao realizar o ensaio, é essencial que eficiente revestimento endotelial dos grânulos ocorre durante o grânulo passos de agitação. Revestimento endotelial pobre será feito evidente, se os grânulos parecem não ter uma superfície áspera, como bola de golfe na manhã.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos os Drs Victoria Bautch e Joshua Boucher discussões úteis e conselhos sobre como otimizar padrão do grânulo brotando condições de ensaio e um ensaio de germinação do protocolo de coloração. S.H.A. foi apoiada em parte por uma concessão do Instituto Nacional de General Medical Ciências, sob 5T32 GM007092 de prêmio.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pontas de pipeta estéreis | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| PBS Gibco | 14190-144 | Magnésio e cálcio livre | |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | para elevação HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | para elevação 10T 1/2 e |
| NHLF Alfândega siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarriers beads | Sigma | C3275 | |
| Placas de 6 e 10 cm revestidas com cultura de tecidos | Corning | ||
| Fibrinogen de plasma bovino | Sigma | F8630 | |
| Trombina | Sigma | t9549 | |
| Aprotinina | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Incubadora de cultura de tecidos e capuz | |||
| Placas de fundo de vidro de 24 poços | MatTek | P24G1.513F | As placas de fundo de vidro são necessárias apenas se os brotos forem fotografados. Caso contrário, o plástico de cultura de tecidos também é aceitável. |
| filtração estéril |
Referências
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M.
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Reimpressões e permissões
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